2017 Fiscal Year Research-status Report
細胞内シグナル伝達の一過的な制御を目指した新規RNA変異導入技術の開発と応用
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16K01926
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| Research Institution | Fukuoka University |
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Principal Investigator |
福田 将虎 福岡大学, 理学部, 助教 (90526691)
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| Project Period (FY) |
2016-04-01 – 2019-03-31
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| Keywords | RNA編集 / ガイドRNA / 遺伝子変異導入技術 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
本研究は、細胞内タンパク質機能をRNAレベルで制御する方法の開発を最終目標とし、RNA編集機構を利用した部位特異的RNA変異導入技術の開発を行っている。本研究ではこれまでに、RNA編集酵素である二本鎖RNA特異的アデノシンデアミナーゼ（ADAR）の編集活性を目的部位に誘導可能なガイドRNA（編集ガイドRNA: AD-gRNA）を設計・構築している。また、編集ガイドRNAをADAR発現細胞内に導入することで、標的RNAに変異導入が可能であること及び、そのRNA変異導入により目的遺伝子の機能発現制御が可能であることを実験的に証明している。AD-gRNAの機能領域は、標的RNAと塩基対を形成するアンチセンス領域と、編集活性を目的部位に誘導するADAR誘導領域である。本年度は、AD-gRNAのADAR誘導領域の短鎖化を行なうことで、編集誘導メカニズムの解析を進めると共に、更なる高機能なAD-gRNAの設計方法を確立することを目的とした。そこでまず、グルタミン酸受容体mRNA前駆体配列を用いて構築したAD-gRNAを基盤として、各種欠損変異体gRNAを設計・合成し、in vitroにおける編集誘導能を評価した。得られた結果から、編集誘導に必要な領域を特定し、短鎖型AD-gRNAを構築した。得られた短鎖型AD-gRNAは、従来型のAD-gRNAと比較して遜色のない機能を示した。また、短鎖型AD-gRNAは、ADAR発現細胞内においても、従来型と同様に編集誘導活性を示し、標的遺伝子発現の制御が可能であることが明らかになった。以上の結果より、当該年度では、短鎖型AD-gRNAを用いた新たなRNA変異導入技術の基盤的方法論を確立することに成功した。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
平成２９年度は、従来のAD-gRNA配列を基盤として、短鎖型AD-gRNAの設計方法を確率し、それを用いた新たなRNA変異導入技術の基盤的方法論を確立した。得られた成果により、より高効率かつ特異的なガイドRNAの設計が可能になった。加えて、平成３０年度で研究予定である、RNA変異導入による内在性遺伝子の制御技術の確立及び人工核酸の導入実験において、短鎖型AD-gRNAは重要な基盤分子となる。以上より、平成２９年度に行った研究及び、それにより得られた研究成果は、申請当初の研究計画と大きな違いはなく、本研究はおおむね順調に進展していると言える。
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| Strategy for Future Research Activity |
平成３０年度は、申請時の研究計画に従い、AD-gRNAを用いたRNA変異導入技術の変異導入効率及び選択性を向上させ、細胞内の遺伝子機能を一過的に制御可能な遺伝子制御技術として確立することを目的とする。そのため、様々な培養細胞内において、これまでに構築したAD-gRNAの機能を評価する。同時に、AD-gRNAを内在性遺伝子に対するRNA変異導入に適用し、本技術が核酸製剤及び核酸医薬品として展開が可能であるかを検証する。平成３０年度は、まず、これまでに確率したレポーターアッセイ（改変型GFP遺伝子及びルシフェラーゼ遺伝子を用いたAD-gRNAの細胞内RNA編集誘導活性を評価する実験系）を用いて、各種AD-gRNAの編集誘導活性のより詳細な解析を行う。この際、AD-gRNAの細胞導入方法（リポフェクション、ウイルスベクター）を標的細胞に合わせて再検討する。また、AD-gRNA配列に機能性配列（核移行シグナル、分解耐性配列、等）を付加し、更なる高機能なAD-gRNA配列の取得を試みまる。さらに、AD-gRNAに人工核酸を導入し、培養細胞内での機能を評価する。最終的には、内在性ADARのRNA編集活性を利用し、AD-gRNA導入のみで合目的な変異導入が達成できる方法を開発し、各種条件を最適化する。以上の研究により、高効率かつ簡便なRNA変異技術を開発し、AD-gRNAを変異導入核酸として確立する。
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