2018 Fiscal Year Research-status Report
DNA結合性蛍光プローブによるHDAC活性のイメージング法の開発
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16K01933
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| Research Institution | Osaka University |
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Principal Investigator |
蓑島 維文 大阪大学, 工学研究科, 助教 (20600844)
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| Project Period (FY) |
2016-04-01 – 2020-03-31
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| Keywords | 蛍光プローブ / HDAC / エピジェネティクス / 蛍光イメージング |
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| Outline of Annual Research Achievements |
本研究ではがん、神経変性疾患等に関わる酵素、ヒストン脱アセチル化酵素（HDAC）の細胞内活性検出を目指した蛍光イメージングに取り組んだ。プローブとして、DNA結合色素に基質であるアセチルリジンを連結させた分子を設計・合成し評価を行った。脱アセチル化反応が起こると、中性のアセチルリジンが正電荷を持つリジンへと変換されることで、DNAに結合しやすくなり蛍光が上昇する機構を利用している。
本年度では細胞内で発現するHDACに対する最適な基質の探索を進めた。HDACの阻害剤の構造に着目して設計した、アセチルリジンのC末端側に芳香族性の官能基を導入したプローブが良好な基質としてはたらくことを見出したため、さらに分子設計の検討を行った。DNA結合色素の結合位置をアセチルリジンのN末端側にしても、C末端側にしたプローブをそれぞれ合成し、評価したところ、いずれも核内に豊富に存在するHDACであるHDAC2との反応性が向上し、DNA存在下で蛍光強度が上昇することが示された。上昇の程度はC末端側に結合させたものの方が若干大きい結果となった。これらのプローブとHeLa細胞の核抽出液と反応させて、細胞内（核内）に存在するHDACとの反応性、検出ができるかどうかを確かめた。いずれのプローブも核抽出液によって脱アセチル化が起こることを確認し、DNA存在下で蛍光の上昇が見られた。これらの結果から、本検出系が細胞核に内在的に発現しているHDACの活性を検出できることが示された。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
本研究で開発した蛍光プローブを用いることで、核抽出液と反応させた際に脱アセチル化が起こり、蛍光上昇が見られたことから、核に存在している内在性のHDACを検出することに成功したといえる。そのため、上記の評価とした。
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| Strategy for Future Research Activity |
今後は、今回の研究で見出した蛍光プローブを用いて、生細胞イメージングへ展開する。細胞内で十分なコントラストを有して核内から蛍光が観察されるかどうかを確認する。また、研究成果の発表に向けたデータの取りまとめも進めていく。
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| Causes of Carryover |
開発した蛍光プローブが細胞に内在的に発現している酵素と反応し、蛍光検出できる可能性を示したため、補助事業期間を延長して当該研究を進めることとした。開発したプローブの細胞イメージングに向けた実験用試薬の購入および、成果発表のための旅費に充てる予定である。
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