2017 Fiscal Year Research-status Report
非天然官能基ポスト標識技術による微小マイクロ結晶構造解析法の開発と応用
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16K01942
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| Research Institution | Institute of Physical and Chemical Research |
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Principal Investigator |
別所 義隆 国立研究開発法人理化学研究所, 放射光科学総合研究センター, 客員研究員 (70242815)
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| Project Period (FY) |
2016-10-21 – 2020-03-31
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| Keywords | 生物・生体工学 / バイオテクノロジー / 結晶構造 / タンパク質 / ｔRNA / メチル基転移酵素 / 人工補酵素 / S-アデノシルメチオニン |
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| Outline of Annual Research Achievements |
AdoMetを補酵素とするDNAメチル基転移酵素の一部には、エチル基やプロピル基などの非天然官能基を導入したAdoMet類似体から、メチル基以外の非天然官能基を転移する能力がある。我々は、RNAメチル基転移酵素を用いて、この非天然官能基の転移が、エチル基などの低分子官能基だけでなく、通常はタンパク質の立体障害のため転移が困難なGABAなどの比較的に分子量の大きな官能基にも適用できることを発見した。この技術を用いれば、タンパク質やRNAなどの生体高分子の特定位置にプローブを導入することを可能とする。昨年度までに、超好熱性真正細菌Aquifex aeolicusのtRNAメチル基転移酵素TrmIを使用して、tRNA分子のT-Loop部位に非天然官能基を取り込ませ、その官能基の末端をビオチン化させる技術を開発した。今年度新たに、tRNA分子に取り込ませた非天然官能基の末端にCy3やCy5などの蛍光色素を導入することに成功した。作製した蛍光化tRNA分子の修飾基が立体障害しないように、T-Loop部位を認識しないtRNA結合タンパク質を選定して、tRNA・タンパク質複合体の結晶化を試み成功した。そして、得られた複合体結晶が導入した蛍光を発することを確認した。SPring-8大型放射光施設のマイクロフォーカスビームラインで微小蛍光結晶を検出する技術開発のために、tRNA・タンパク質複合体結晶の最適化を続けている。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
超好熱性真正細菌のメチル基転移酵素の触媒部位の立体構造から、結晶化用に長さを最適化した非天然官能基を有する人工補酵素をデザインした。tRNA分子の特定部位に、有機合成した非天然官能基が効率よく転移されることを確認し、今年度予定通りにtRNAとtRNA結合タンパク質複合体の蛍光結晶を作製できた。
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| Strategy for Future Research Activity |
今年度までに最適化された非天然官能基を有するAdoMet類似体が、多くのメチル基転移酵素に適用できるならば、汎用的な生体分子工学に応用できる。今後、SPring-8大型放射光施設のマイクロフォーカスビームラインで、蛍光標識した微小マイクロ結晶のX線回折測定技術を開発する。
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| Causes of Carryover |
理由：既存の機材や実験材料を多く使用して効率よく研究を進めた。研究課題は、計画通り進んでいる。
使用計画：研究課題が当初の計画以上に進展するように、次年度使用額を効率よく使用する。
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Research Products
(6 results)
