2020 Fiscal Year Research-status Report
非天然官能基ポスト標識技術による微小マイクロ結晶構造解析法の開発と応用
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16K01942
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| Research Institution | Institute of Physical and Chemical Research |
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Principal Investigator |
別所 義隆 国立研究開発法人理化学研究所, 放射光科学研究センター, 客員研究員 (70242815)
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| Project Period (FY) |
2016-10-21 – 2022-03-31
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| Keywords | 生物・生体工学 / バイオテクノロジー / 結晶構造 / タンパク質 / メチル基転移酵素 / tRNA / 人工補酵素 / S-アデノシルメチオニン |
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| Outline of Annual Research Achievements |
AdoMetを補酵素とするDNAメチル基転移酵素の一部には、AdoMetの代わりに人工官能基を持つAdoMet類似体を使用することで、天然のメチル基以外に、エチル基やプロピル基などの非天然官能基も転移する能力がある。我々は、RNAメチル基転移酵素を用いて、この転移が低分子官能基だけでなく、通常は立体障害のため反応が困難なGABAなど比較的に分子量の大きな官能基にも適用できることを発見した。これを応用し生体高分子の特定の位置にプローブを導入する技術開発を進めている。昨年度までに、超好熱性真正細菌Aquifex aeolicusのメチル基転移酵素TrmIを使用し、tRNA分子のT-Loop部位にCy3、Cy5やローダミンなどの蛍光色素を導入する技術を開発した。この蛍光ラベルしたtRNAと、立体障害を考慮してT-Loop部位を認識しないtRNA結合タンパク質の複合体を作製し、その結晶化に成功した。SPring-8のマイクロフォーカスビームライン・BL32XUに蛍光・レーザー装置を設置し、Ｘ線測定に使用するゴニオステージ上で、この結晶から蛍光の検出に成功した。今年度、開発した蛍光・レーザー装置を高度化し、UV波長により励起する蛍光色素も検出できるようになった。それぞれの蛍光色素について蛍光結晶の退色が起こらないレーザー強度を調べたところ、UV波長の蛍光は可視光に比べて強度が若干弱く、実用とするには改善が求められることが分かった。非天然官能基の導入により作られた蛍光tRNA・タンパク質複合体の結晶化条件を最適化し、BL32XUの特性を生かす蛍光マイクロ結晶を作製した。このtRNA・タンパク質複合体の蛍光マイクロ結晶から、構造解析用のＸ線回折データセットの取得に成功した。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
3: Progress in research has been slightly delayed.
Reason
超好熱性真正細菌のメチル基転移酵素の触媒部位の立体構造から、最適化された非天然官能基を有する人工補酵素を有機合成し、基質tRNA分子の特定部位に蛍光色素を含む非天然官能基が効率よく転移されることを確認した。今年度までに予定通り、tRNA結合タンパク質と基質tRNA複合体のマイクロ蛍光結晶を作製し、SPring-8のマイクロフォーカスビームラインのＸ線測定装置ゴニオステージ上で結晶由来の蛍光を検出できた。構造解析用のＸ線回折データセットの取得にも成功したが、最終的な研究まとめに遅れが生じている。今後、成果発表のための学会参加や論文作成を行う。
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| Strategy for Future Research Activity |
今年度までに最適化された非天然官能基を有するAdoMet類似体が、多くのメチル基転移酵素に適用できるならば、汎用的な生体分子工学に応用できる。今後、SPring-8大型放射光施設のマイクロフォーカスビームラインで得られたマイクロ結晶の構造分析を進め、適用できるメチル基転移酵素を考察する。
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| Causes of Carryover |
理由：既存の機材や実験材料を使用して効率よく研究を進めたが、研究成果のとりまとめが遅れて1年間の研究課題延長を申請した。
使用計画：研究課題が当初の計画通りに進展するように、次年度使用額を効率よく使用する。
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