2021 Fiscal Year Annual Research Report
Development of protein microcrystallography applied by an effective post-labeling method, using methyltransferases and synthetic AdoMet-derivatives
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16K01942
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| Research Institution | Institute of Physical and Chemical Research |
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Principal Investigator |
別所 義隆 国立研究開発法人理化学研究所, 放射光科学研究センター, 客員研究員 (70242815)
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| Project Period (FY) |
2016-10-21 – 2022-03-31
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| Keywords | 生物・生体工学 / バイオテクノロジー / 結晶構造 / タンパク質 / メチル基転移酵素 / tRNA / 人工補酵素 / S-アデノシルメチオニン |
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| Outline of Annual Research Achievements |
AdoMetを補酵素とするDNAメチル基転移酵素の一部には、AdoMetの代わりに人工官能基を持つAdoMet類似体を使用することで、天然のメチル基以外にエチル基やプロピル基などの非天然官能基も転移する能力がある。我々は、RNAメチル基転移酵素を用いて、この転移が低分子官能基だけでなく、通常は立体障害のため反応が困難なGABAなど比較的に分子量の大きな官能基にも適用できることを発見した。この技術を応用すれば、生体高分子の特定の位置にプローブを導入することが可能になる。昨年度までに、超好熱性真正細菌Aquifex aeolicusのメチル基転移酵素TrmIを使用し、tRNA分子のT-Loop部位にCy3、Cy5やローダミンなどの蛍光色素を導入する技術を開発した。この蛍光色素を導入したtRNAと、tRNA結合タンパク質の複合体の結晶化に成功した。SPring-8のマイクロフォーカスビームライン・BL32XUに蛍光・レーザー装置を設置し、Ｘ線測定に使用するゴニオステージ上で、この結晶から実際に蛍光の検出に成功した。今年度、非天然官能基の導入により作られた蛍光tRNA・タンパク質複合体の結晶化条件をさらに最適化し、BL32XUの特性を生かす蛍光マイクロ結晶を作製した。このtRNA・タンパク質複合体の蛍光マイクロ結晶から、構造解析用のＸ線回折データセットの取得し、位相回復に成功した。また、リトアニアの海外共同研究者が開発したDNAメチル基転移酵素の非天然官能基プロービング法を応用し、BL32XUでDNA修復酵素のマイクロ結晶の最適化にも成功した。SACLAのXFELにも使用できるマイクロ結晶から、高分解能のＸ線回折データが得られる実験条件を見出した。
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[Journal Article] Serial crystallography captures dynamic control of sequential electron and proton transfer events in a flavoenzyme2022
Author(s)
Maestre-Reyna M, Yang CH, Nango E, Huang WC, Putu EPGN, Wu WJ, Wang PH, Franz-Badur S, Saft M, Emmerich HJ, WHY, LCC, HKF, CYK, LJH, WJH, GW, CCW, PAH, SM, OS, HY, JY, YA, TR, TT, LF, TK, HKC, KS, Schapiro I, Spadaccini R, Royant A, Yamamoto J, Iwata S, Essen LO*, Bessho Y*, Tsai MD*
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Journal Title
Nature Chemistry
Volume: －
Pages: －
DOI
Peer Reviewed / Int'l Joint Research
