2016 Fiscal Year Research-status Report
マイクロチャンバーを用いて解明する微小管の動的不安定性
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16K04909
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| Research Institution | Tokyo University of Science |
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Principal Investigator |
政池 知子 東京理科大学, 理工学部応用生物科学科, 講師 (60406882)
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| Project Period (FY) |
2016-04-01 – 2020-03-31
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| Keywords | 微小管 / 動的不安定性 / マイクロチャンバー |
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| Outline of Annual Research Achievements |
本研究の最終目的は、微小管の伸長と短縮の間の遷移は必ずしもGTPの加水分解過程に共役しないとする構造可塑性モデルの正否に決着をつけることである。そのためにまず、微小管から解離した基質の局所イメージングが可能になると考えられる狭小空間での微小管ダイナミクス観察を行うことを目標とした。
これまで、細長いPDMSチャンバー内での微小管の重合・脱重合に成功したものの安定的な実現が困難でその原因が定かでなかったが、一旦、フローセルを用いた従来からの重合・脱重合の対照実験にもどり、微小管の動的不安定性を調べるために用いる試薬や酵素の保存方法や実験手順を見直し、重合そのものは文献値同様の速度で安定的に実現できるようになった。さらに、シード非存在下の溶液中においては、微小管を細長い微小空間に閉じ込めて重合観察を行うのは容易であり、再現性が高いことがわかった。これらの実験から、細長いチャンバーに微小管シードを閉じ込めてシードからの伸長を見るためには、チャンバーの長軸方向とガラス表面へのシードの結合方向の関係が肝心であることがわかってきた。
また、この実験の過程で、pyruvate kinaseとphosphoenol pyruvateを用いたATP再生系をGTP再生に応用することが可能であることを見出した。通常分光器測定に用いる場合にはこの系にNADHを添加しその吸光度測定によるATPase活性測定を行うが、この成分については蛍光観察を阻害することがわかったため、添加しないこととした。これらの結果から、重合・脱重合反応中のGTP濃度を一定に保ち、既知濃度GTPでの重合速度を見積もることができるようになった。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
研究実績の概要でも述べたとおり、狭小空間における微小管の重合・脱重合に重要な要素を理解したことは、基礎的な進捗ではあるが今後の研究の進捗にとって必須であり、その意義は大きい。これまでのところ、1 μm×1 μm×20 μmの直方体をした空間をアレイ状に並べたPDMS樹脂製マイクロチャンバーでも、ガラスに固定しない溶液中の微小管重合は安定して観察できていることから、固定されたシードへの重合が妨げられないように工夫すれば、ガラス表面上でのダイナミクス観察も成功率が上がると見込まれる。このことから、研究の進捗状況は問題ないと考える。
GTP再生系については、微小管上でのGTP加水分解後に溶液中に徐々に蓄積するGDPの濃度の見積もりが不要になることから、ヌクレオチド条件を固定して実験を行うことができるようになり、微小管ダイナミクスとヌクレオチド条件の関係を調べるために重要なツールを手に入れたと言える。これは、GTPの加水分解過程に微小管の重合・脱重合が共役するかどうかを考えるために重要な点であるため、進捗があったと言える。
さらに、PDMSチャンバーだけでなく、油中の水滴をチャンバーとするdroplet chamberについてもラボ内で日常的に使用し、リン酸結合蛋白を封入した実験を行うようになった。これは、微小管から解離するリン酸を局所的に検出するために重要なステップであり、この点でも進捗があったといえる。
これらの進捗を総合し、本研究における平成28年度の進捗はおおむね良好であると結論した。
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| Strategy for Future Research Activity |
今後は直方体形のチャンバーへの封入条件を最適化することと並行し、円柱形のマイクロチャンバーアレイも用いて微小管の重合・脱重合を行う。これにより、シードが向いている方向によらず伸長が可能になると考えられる。これでガラス基板上での重合の成功率が劇的に向上するようであれば、円柱形チャンバーの方で以後の実験を進める方策をとる。また、PDMS樹脂で壁を作って囲う方式ではなく油中の水滴に微小管シードを閉じ込めて観察する方法も検討する可能性がある。これは、PDMSによる物理的な封入の失敗を回避することができる可能性が高いからである。
GTP再生系については、とくに脱重合のGDP濃度依存性を定量化する実験において、対照実験として用いる事が出来ると考える。溶液中のGDPの有無によりダイナミクスに違いがみられるかどうかを調べ、微小管上のGTP・GDPの分布がダイナミクスに与える影響の評価を行う。たとえば、溶液中でGTP再生系により再生されたGTPが微小管上のGDPと交換するようであれば、前述の構造可塑性モデルの正否を考える材料となるはずである。
微小空間内での微小管ダイナミクス観察の先には、微小管上のヌクレオチド分布の決定を計画している。蛍光性基質GTPによる重合・脱重合の観察や、微小管から解離したGTP加水分解産物のリン酸のリン酸結合蛋白による局所的な可視化を実現するために必要となる実験を積み重ねていく予定である。
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| Causes of Carryover |
基本的にはほぼ計画通りの予算執行を行い、次年度使用額となった金額は当該年度交付額の約0.3 %とごく少額である。従って、繰り越し額の発生に大きな理由はない。ただし、平成29年度の交付予定額は平成28年度よりも少なく、平成28年度よりも沢山の試薬を購入する必要がある可能性が高いため、少額であっても平成29年に繰り越す必要があると判断した。
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| Expenditure Plan for Carryover Budget |
顕微鏡観察用の消耗品、サンプル調製のための試薬等の購入に使用する予定である。
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