2017 Fiscal Year Research-status Report
Dynamic instability of microtubules investigated by microchambers
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16K04909
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| Research Institution | Tokyo University of Science |
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Principal Investigator |
政池 知子 東京理科大学, 理工学部応用生物科学科, 講師 (60406882)
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| Project Period (FY) |
2016-04-01 – 2020-03-31
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| Keywords | 微小管 / 動的不安定性 / 構造可塑性 / 極小体積 / マイクロチャンバー |
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| Outline of Annual Research Achievements |
本研究の最終目的は、微小管の伸長と短縮の間の遷移は必ずしもGTPの加水分解過程に共役しないとする構造可塑性モデルの正否に決着をつけることである。
そのためにまず、微小管から解離した基質の局所イメージングが可能になると考えられる狭小空間での微小管ダイナミクス観察を行うことを目標とした。H28年度は微小管を細長い微小空間に閉じ込めて重合観察を行ったが、初期にガラス基板に固定されるシードの向きによっては重合が困難である事が示唆されたため、H29年度にはシードの角度にかかわらず全方向に伸長が可能である円筒形の極小PDMS樹脂製チャンバー内での微小管重合を試みた。その結果、ガラス基板上での微小管重合が容易に観察され、チャンバーの壁に接触した微小管が湾曲しながら重合を続けることがわかった。
次に、微小管上に結合したGTP, GDP, Piの分布を区別してイメージングを行うための準備として、蛍光分子がγ位のリン酸に結合した蛍光性GTPによる微小管重合を試みた。これまでのところ顕微鏡下での重合は確認されていないが、この実験の過程で通常のGTPによる重合条件の再検討も行い、本研究のために最適化された重合条件を決定した。
最後に、暗視野照明下の微小管観察を立ち上げ、対物型全反射顕微鏡を使用せずとも蛍光性GTPによる微小管重合を簡便に確認できる方法を使用できるようになった。これらの成果により、構造可塑性モデルの検証のみならず、微小管構造の安定性や極小空間での振る舞いなどについての総合的な検証が可能になりつつある。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
研究実績の概要でも述べたとおり、再現性よく円筒チャンバー内での微小管重合が可能になったことは、極小空間における微小管重合の定量的な評価法の確立に繋がる成果であると考えられる。これまでの実験により、マイクロリットル体積のフローセルと数十フェムトリットル体積の円筒形チャンバーにおける重合を比較したところ、微小管濃度が同程度でも、チャンバー内での微小管重合速度の方がフローセルよりも高いことが示唆された。慎重な対照実験による検証が必要ではあるが、極小体積の効果による実効的なチューブリン濃度の違いを検証する糸口がつかめたと考える。また、一旦チャンバー内で１本の微小管の重合が始まると、極小空間においては重合する１本の微小管が占める体積(マクロな意味では濃度に相当する)が小さいことにより重合が加速している可能性もある。
一方、円筒形チャンバー内では微小管が壁に到達後に湾曲しながら重合を続けたことから、微小管が物理的な障壁で重合停止や脱重合を来さず、重合を続けることがわかった。微小管は一般的にアクチン線維よりも硬く、形状の柔軟性が低いと言われているが、その微小管がどの程度湾曲すると重合を停止するのかを定量することができる可能性があると考えられる。これは、微小管の構造可塑性の検証にもつながると考える。
その他、蛍光性GTPによる重合の試みや暗視野照明下での微小管重合観察についても、研究室内における実験技術の進展があり、今後の研究を加速させるために有効であると考えられる。
これらの進捗を総合し、本研究における平成29年度の進捗はおおむね良好であると結論づけた。
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| Strategy for Future Research Activity |
今後は、まず円柱形のマイクロチャンバーアレイによる微小管重合の定量化をさらに進める。数十フェムトリットル桁の極小体積内においてマイクロリットル桁のフローセル内に比べて微小管重合速度が大きいという結果を定量化する。これについては、チャンバーの乾燥などのアーティファクトを取り除いて再確認を行う。この実験のために、顕微鏡ステージの保温と保湿のための治具を特注し、より確実な条件でのダイナミクス観察を目指す。また、三角柱など、円柱以外の形状のマイクロチャンバーによる重合も試みる。これらの実験で得られた画像から、微小管の湾曲によって微小管にかかる力の計算も行い、微小管構造の歪みによる重合・脱重合への影響について考察する。
蛍光性GTPによる微小管の重合については、重合が促進されると考えられる非修飾のGTPと混合した条件で観察を試みる。また、GTP再生系も共存させ、マグネシウムイオン濃度が適正であるかも再検討する。現在用いている蛍光性GTPによる重合が達成できない場合には、重合実績のある異なる化学構造の蛍光性GTPに切り替えて同様の実験を行う。
一方、微小管から解離したリン酸の可視化のための準備も行う。これについては、まずは円筒形のチャンバーによるリン酸濃度決定の実績を上げることが急務である。
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| Causes of Carryover |
平成29年度はおおむね計画に従って予算の執行を行った。平成30年度には、微小管重合のために顕微鏡の周辺治具を購入する必要があるが交付予定額が平成29年度よりも少ないため、平成30年に一部を繰り越す必要があると判断した。また、本研究課題遂行の後半にかけて実験が加速すると予想されるため、試薬等の購入代金が必要になると考えた。
平成30年度には、本予算を顕微鏡観察用の温度調整用治具特注代金、サンプル調製のための試薬代金、共同研究のための旅費などに使用する予定である。
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