2016 Fiscal Year Research-status Report
強磁場を利用した純良大型タンパク結晶の革新的育成方法の開発
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16K04946
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| Research Institution | Yokohama National University |
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Principal Investigator |
山本 勲 横浜国立大学, 大学院工学研究院, 教授 (40242383)
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| Project Period (FY) |
2016-04-01 – 2019-03-31
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| Keywords | 磁場効果 / 結晶成長 / 液-液界面析出法 / タンパク質 / リゾチーム / タウリン / グリシン |
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| Outline of Annual Research Achievements |
強磁場の作用によって純良で巨大なタンパク質の結晶を得ることを目的として、アミノ酸のグリシンとタウリン、タンパク質の鶏卵白リゾチームを対象とし研究を進めた。これらについては液-液界面析出法による結晶作製の文献（特に宇宙実験の報告）を参考にして磁場効果を追求した。
タンパク質の構成要素であるアミノ酸のグリシンは、飽和水溶液に１-プロパノールまたはエチルアルコールを重層した２種類の液-液界面から結晶を析出させて結晶形を評価した。結晶核形成および結晶成長位置を磁場で制御することによって、α、β、γ型の多形制御および収率制御が可能であることを見出した。タウリンについては通常得られる柱状結晶のほかに、磁場中ではタンク状の結晶が得られた。これは結晶核形成と成長の環境が磁場によって低過飽和に変化した結果であり、磁場が対流や拡散に影響を及ぼすことによると考えられる。以上より適切な過飽和度の位置における結晶成長が重要であるとの知見を得た。
リゾチームの結晶作製では結晶化剤として塩化コバルトを用いることで初めて常磁性液体中で結晶作製を試みた。リゾチームを磁場による疑逆転重力環境で48h結晶成長させたところ、無磁場に比較して10倍の大きさの単結晶を得た。X線構造解析により最大分解能が1.2オングストローム、R-mergeが5%であり、無磁場で作製した結晶と同様の純良な品質を担保したまま大型化することに成功した。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
H28年度研究実施計画に基づき、研究を遂行した。タンパク質の構成要素であるアミノ酸のグリシンについて、縦磁場中で液-液界面析出法によって結晶の成長プロセスに及ぼす磁場の影響をその場観察および多形割合（α、β、γ型）をXRDで評価した。無磁場では水溶液と1-プロパノールの液-液界面に留まったまま成長したα型結晶多く占めるのに対し、鉛直磁場中では溶媒媒介転移によって底面で成長したγ型結晶が顕著に増加した。このメカニズムは、結晶の磁場配向で界面張力が減じ、界面から結晶離脱が早まると考えられる。次にエタノールとの界面から不安定なβ型結晶を0℃で析出させた。磁束密度390 T2/mの減重力環境でβ型結晶の収率が無磁場の15%から50%に増加した。グリシンの多形制御について、核形成および結晶成長位置を磁場制御することが重要であるという知見を得た。
タウリンについては、飽和水溶液にエタノールを重層した液-液界面から結晶を得た。無磁場では柱状結晶（最頻直径30μm）が得られたが、縦磁場の過重力環境では4倍の直径120μmの結晶が得られた。過重力環境ではタンク状結晶が多く混入し、低過飽和な状態で結晶が成長した。磁場によって対流や拡散が影響を受け過飽和度が制御されたと考えられる。水平磁場効果として柱状結晶の長さが0.3mmから1.3mmへ増加したこととあわせて、結晶サイズへの磁場効果のメカニズムは結晶の界面に対する姿勢制御であると考えられる。
リゾチームについては結晶化剤として常磁性塩化コバルトを用い18.5℃で液-液界面析出法で結晶を48h育成した。結晶は1辺が無磁場の170μmから磁場中で350μmまで体積にして10倍に巨大化したにも関わらず、X戦構造解析によると品質の低下は見られなかった。
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| Strategy for Future Research Activity |
タンパク質リゾチームについて品質を純良に保ったまま巨大化する磁場効果を認めたので、塩化コバルト以外の常磁性結晶化剤（塩化マンガン、塩化ニッケル）および反磁性結晶化剤（各種塩化物）を用いて磁場効果を追求する。具体的には結晶化剤濃度、pH、温度、良溶媒と貧溶媒の比などをパラメータにして成長過程を顕微鏡観察し、成長した結晶の構造解析を行う。結晶化剤の塩の種類によってリゾチームタンパク結晶の晶系と磁場配向方向が異なるので結晶の質に影響があるモザイシティに改善が期待出来る。
さらに新たなタンパクについて磁場効果の有無および程度を追求する。ソーマチンはリゾチームと並び多く用いられるタンパク質であるが、結晶化はリゾチームより困難とされる甘味タンパクである。様々な結晶化方法が報告されているが、液-液界面からの結晶化報告はない。予備的な実験では結晶化剤である酒石酸塩の析出を抑制しつつソーマチンを結晶化することが肝要であると考えている。数百の結晶化条件のスクリーニングを行い、最適な条件を特定し、磁場効果を追求する。
磁場中液-液界面析出法で様々な結晶に磁場効果が期待出来る。そのメカニズムは完全に判明しておらず、結晶によってどのように異なるかも今のところ不明であるので、本磁場効果が適用できる物質の範囲は未知である。しかしながら、結晶形状のアスペクト比の変化は磁場配向に有利に働き、配向試料は物性の異方性により機能を強化できる。磁場による結晶系（キラルを含む）の制御、あるいは新しい形の結晶創生は新しい産業分野に発展する可能性があり、この方面も同時に推進する。
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| Causes of Carryover |
11万円余の次年度使用額は想定内である。
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| Expenditure Plan for Carryover Budget |
試薬等の物品費に使用する予定である。
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