2016 Fiscal Year Research-status Report
生体分子の水素水和研究に向けた、中性子結晶解析用D/Hコントラスト法の開発
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16K05014
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| Research Institution | Kyoto University |
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Principal Investigator |
茶竹 俊行 京都大学, 原子炉実験所, 准教授 (30383475)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
藤原 悟 国立研究開発法人量子科学技術研究開発機構, 高崎量子応用研究所 東海量子ビーム応用研究センター, 上席研究員(定常) (10354888)
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| Project Period (FY) |
2016-04-01 – 2019-03-31
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| Keywords | 中性子 / 結晶学 / D/Hコントラスト法 / 水和構造 / 生体分子 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
中性子結晶解析は水素と水素イオンの検出力に優れた実験法であり、生体分子内の水素原子と水素イオンおよび、周囲の水和水に含まれる水素原子の位置決定に用いられている。本研究では、中性子線の重水素と軽水素に対する散乱長の違いを利用する重水素/軽水素コントラスト法を中性子結晶解析に導入して、解析の効率と精度を飛躍的に向上させることを目指す。申請者達が独自に考案した、重水素と軽水素のコントラストを実空間差分から計算するアルゴリズムを利用して、中性子結晶解析における重水素/軽水素コントラスト法を実用化する。これにより、高精度での生体分子の水素状態と水和構造の決定が可能となり、中性子結晶解析が生体分子の構造と化学反応を解明するためのより強力なツールとなることが期待される。
リボヌクレアーゼA(RNaseA)を標準タンパク質として中性子結晶回折実験を行い、重水結晶データと軽水結晶データを得た。(1) このデータを用いて、D/Hコントラストのための解析プログラムの開発、(2) 他の量子ビーム実験、具体的には中性子、X線溶液散乱との比較、さらに、(3) 物理化学的性質(特に等電点pI)の違うリゾチームやインシュリンへの本方法の応用と総合的なタンパク質の水素と水和の解釈、そして(4) D/Hコントラストの実用に向けた、ソフトウェアの一般化と整備を目標として、研究を進めている。
28年度は、この4つのテーマについて研究を進め、進展状況で述べるようにほぼ所定の目標を達成した。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
28年度の実施計画は(1) 標準タンパク質(RNaseA)を用いたD/Hコントラストの解析、(2) RNaseAの中性子溶液散乱実験、(3) 実験サンプルの準備、(4) DHコントラスト用プログラムの開発と改良であった。
(1)のRNaseAのD/Hコントラスト解析については、結晶中の全空間についてD/Hコントラストの密度の統計処理を行い水和構造の観察に成功した。(2)の中性子溶液散乱実験については、研究分担者により中性子データの収集が行われた。(3)実験サンプルの準備については、RNaseAは既に実験に必要な大型結晶を保有しており、必要に応じて追加作成が可能な状態である。他のサンプルとして、リゾチームについては市販の鶏卵白リゾチームをFPLC精製することにより、蒸気拡散法で実験に必要な最小限の大きさ(1mm角)の結晶を得ることができた。インシュリンについては当初ヒト由来のインシュリンを試みたが、良質の単結晶は得られたものの大きさが十分でなかった。さらに、ベータラクトグロブリンやナットウキナーゼなどの生産や精製を開始して、ベータラクトグロブリンについてはクルードから安価に精製することに成功した。(4)のD/Hコントラスト用プログラムの開発と改良については、当初予定していた(a)D/Hコントラスト計算プログラムのPerlからPython3への移植はソースの書き換えと動作確認を終了した。(b)D/Hコントラスト密度解析プログラムについてはPython3とFortran77(g77)を用いてソースを書き、動作確認を行った。この密度解析プログラムは(1)のD/Hコントラストの解析に使用している。
以上、予定していた４つの計画のうち、(3)の一部を除いては予定通り遂行できたので、概ね順調に進んでいると判断した。
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| Strategy for Future Research Activity |
29年度以降は28年度に行った(1)-(4)の結果を発展させて、次の3つについて研究を進めていく。
(A) RNase AのD/Hコントラストの多角的な解析：結晶構造から得られたD/Hコントラスト解析の結果(進展状況の1)と中性子溶液散乱実験の結果(進展2)を組み合わせて、RNase Aの水和構造について結晶と溶液を統合した解釈を試みる。このために必要な、解析法とプログラムの開発も行う。
(B) 中性子実験の準備と実行: 当初の実験計画に記載したリゾチームとインシュリンの中性子実験を優先して実現を目指す。リゾチームについては、既に必要最小限の結晶が得られているが、シーディング法などでより大型の結晶の作成を目指す。インシュリンについては、28年度はヒト由来の試料を結晶化に使用していたが、良質ではあっても大型の結晶は得られていない。過去に大型結晶化の実績があるブタ由来インシュリンやウマ由来インシュリンも併用しておこない、中性子実験に必要な結晶作成を目指す。他のサンプル(ベータラクトグロブリン、ナットウキナーゼ)なども並行して進める。
(C) D/Hコントラストプログラムの改良と作成: 28年度には基本的なプログラムについては、Python3+Fortran77でのソースを作成した。今後は、(i) 安定動作(バグフィックス、高速化)のための検証と改良、(ii) RNase A用に特化した箇所を一般化して、様々なD/Hコントラストに適応できるようにする。また、GUIの実装も計画する、(iii) 解析に必要な更なる追加プログラムの開発、を行う予定。
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| Causes of Carryover |
本年度は、直接経費の95%以上を使用した。111,384円の次年度使用額が生じた理由は進展状況の(3)で報告したインシュリンの結晶化の遅延によるものである。これまでに、ブタもしくはウマ由来のインシュリンについては結晶化の実績があったが、今回は医学と薬学への貢献も視野におき、ヒトインシュリンを用いた。良質の単結晶は比較的早く得ることができたが、大型結晶の作成にはいたらず、ブタ、ウマ由来のインシュリンとの実験を併用するか否かについて時間を要した。このため、インシュリンの結晶作成用消耗品について次年度で購入することとなった。
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| Expenditure Plan for Carryover Budget |
次年度使用分については、インシュリンの結晶作成用消耗品の購入を計画している。今後の方針(B)で述べたように、ヒト由来インシュリンに加えてウマ由来およびブタ由来インシュリンについても併せた消耗品の購入とする予定。
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[Presentation] 構造状態と関係したヘモグロビンのピコ秒ダイナミクスの変化2016
Author(s)
Satoru Fujiwara, Toshiyuki Chatake, Tatsuhito Matsuo, Fumiaki Kono, Taiki Tominaga, Kaoru Shibata, Ayana Sato, Naoya Shibayama
Organizer
日本生物物理学会年会
Place of Presentation
エポカル筑波
Year and Date
2016-11-27 – 2016-11-27
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[Presentation] 中性子タンパク質結晶構造解析での水素高感度検出のための動的核偏極法の予備的結果2016
Author(s)
Naoya Komatsuzaki, Ichiro Tanaka, Takahiro Iwata, Daisuke Miura, Yoshiyuki Miyachi, Genki Nukazuka, Hiroki Matsuda, Toshiyuki Chatake, Katsuhiro Kusaka, Nobuo Niimura
Organizer
日本生物物理学会年会
Place of Presentation
エポカル筑波
Year and Date
2016-11-26 – 2016-11-26
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