2016 Fiscal Year Research-status Report
Bacillus属細菌胞子の発芽・増殖過程の劣化を指標とした損傷菌生成機構の解析
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16K05018
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| Research Institution | Osaka Prefecture University |
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Principal Investigator |
古田 雅一 大阪府立大学, 工学(系)研究科(研究院), 教授 (40181458)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
坂元 仁 大阪府立大学, 研究推進機構 21世紀科学研究センター, 客員研究員 (40570560)
土戸 哲明 大阪府立大学, 研究推進機構 21世紀科学研究センター, 客員教授 (50029295)
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| Project Period (FY) |
2016-04-01 – 2019-03-31
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| Keywords | Bacillus subtilis / 芽胞 / 放射線照射 / 発芽 / 増殖 / 損傷 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
本研究においてはBacillus subtilis芽胞の発芽・増殖過程に着目し、60Coγ線照射に対して芽胞の発芽・増殖過程のどの段階の損傷が細胞致死の要因となるのかを明らかにすることが最終目標である。。本年度は芽胞のガンマ線発芽増殖過程をマイクロプレートリーダ―により得た増殖曲線と顕微鏡観察により検討し、発芽増殖過程におけるガンマ線照射後の影響について調べた。同時にこれらから得られたゲノムDNAの電気泳動により、DNA切断、修復の状況をモニターした。
Bacillus subtilis 168株から芽胞を調製し、種々の線量の60Coγ線を照射したのち，コロニー計数法により生残曲線を得た。ガンマ線照射後の芽胞は指数関数的に減少し、D10は約2.1 kGyを示した。
次にマイクロプレートリーダーによりLB培地中での損傷芽胞の発育過程を追跡した。さらにL-アラニンによる発芽処理についても検討した。その結果、γ線及び加熱により芽胞の発育遅延が見られ、B. subtilis芽胞の発芽システムはγ線ではほとんど損傷せず、98℃加熱では損傷することが示唆された。位相差顕微鏡像観察から、L-アラニンによる発芽処理にγ線照射芽胞は正常に応答したが、98℃加熱処理芽胞の一部では発芽応答が見られなかった。
さらに芽胞の発芽増殖過程において経時的に試料を採取し、ゲノムDNAを抽出し、制限酵素NotIにより断片化したDNAに対し、パルスフィールドゲル電気泳動を行なった。その結果から、γ線と98℃加熱処理ではB. subtilis芽胞に与える損傷は異なり、γ線では主にDNAに、98℃加熱処理芽胞では芽胞表層の発芽システムに損傷を及ぼすことが推察された。現在は研究計画に従い、芽胞の発芽増殖過程の生理活性変化、細胞損傷、細胞分裂の変化を蛍光色素染色により可視化し、顕微鏡観察により評価しているところである。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
3: Progress in research has been slightly delayed.
Reason
当初平成29年度においては芽胞の発芽増殖過程をDNA 染色試薬や酵素活性評価試薬を用いて染色し、Co-60γ線照射後の芽胞の発芽増殖過程における生理学的変化を明らかにする予定であった。しかし染色条件の検討に思いのほか時間がかかり、現時点では十分な結果が得られていない次年度の早い時期にこれらを明らかにし、放射線の影響によって発芽ご生育のどのステージに異常が認められ、また回復、損傷にいずれかに至る要因は何かについてできるだけ早く明らかにする予定である。
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| Strategy for Future Research Activity |
現在のところ前項でも述べたように若干の進捗の遅れはみられるが概ね計画通りに進んでいると考えている。今後はDNA 染色試薬や酵素活性評価試薬の染色条件を早急に確立し、顕微鏡観察 することにより、放射線の影響によって発芽のどのステージに異常が認められるか明らかにする。得られた情報とパルスフィールドゲル電気泳動の結果とリンクさせることにより、芽胞の発芽後増殖の過程における回復のポイントを明確にし、さらにBacilus subtilisの DNA 修復に関与することが明らかなタンパク質（例えば切断 DNA の非相同末端結 合の補助因子 YkoVU タンパク質など）について、遺伝子組換えにより GFP 融合タンパク質 生産株を作成し、放射線照射の有無による栄養細胞、胞子、発芽胞子における発現パター ンや局在部位の違いを確認する。胞子または発芽胞子に存在が確認されたタンパク質につ いて、該当遺伝子の破壊株を用いて放射線感受性の違いを検討する。
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