2017 Fiscal Year Research-status Report
高い細胞認識能を有するDNAアプタマーの高速な電気泳動選抜法の開発
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16K05808
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| Research Institution | Saitama University |
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Principal Investigator |
齋藤 伸吾 埼玉大学, 理工学研究科, 教授 (60343018)
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| Project Period (FY) |
2016-04-01 – 2019-03-31
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| Keywords | DNAアプタマー / 細胞 / キャピラリー電気泳動 / in vitro選抜 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
ある特定の分子を認識可能なDNAをDNAアプタマーといい，抗体に代わる分子認識素子として注目されている。DNAアプタマーを得る進化工学手法としてSELEX法（in vitro selection法）が知られているが，細胞や細菌に対するSELEX法は1～数ヶ月もの長時間を要し，かつ高アフィニティーのアプタマーが得られるとは限らないといった欠点がある。本研究の目的は，キャピラリー電気泳動法を基盤として，細胞（粒子系）とDNA（分子系）の高度な濃縮-分離-分取を達成することで，動物細胞・細菌・ウィルスに対して高いアフィニティーを有するDNAアプタマーを数日～一週間以内で確実に獲得できる新規方法論を確立することである。
平成28年度は効率的な細胞とDNAランダムライブラリーの分離-分取工程をCEで行う新規手法（PectI選抜法）の開発に成功し，特に動物細胞であるヒト肺腺がん細胞株PC-9結合型のDNAアプタマープールを得ることができた。本年度は，得られたDNAプールの次世代シーケンサーによる大規模解析を行った。得られた配列データを多重配列解析することで，得られた膨大な配列データの中からアプタマーを識別する手法の開発に取り組み，DNAアプタマーがデータ中に類似配列群を形成し，アプタマー配列として識別可能であることが分かった。これらアプタマー候補群とPC-9細胞との結合実験を行い，実際に結合能があることが判明した。また，簡易なカウンター選抜との併用でPC-9選択的な配列が得られることが実証された。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
DNAアプタマーを獲得・評価する上での一連の工程（結合-分離-分取-増幅-配列解析-結合能測定）のうち本手法の鍵となる分取までは28年度に確立していたが，29年度には配列解析手法を開発し，DNAアプタマーを配列情報から80%程度の確立で識別できることが分かった。この様に，細胞に結合する高性能DNAアプタマーの高速選抜法の一連の工程を確立したため，おおむね順調に進展している。一方，計画していたカウンター選抜の導入による特定のタンパク質に対する選抜法の開発は若干遅れている。理由は，既にアプタマーの報告のある細胞表面のリポ多糖（LPA）をモデルターゲットとしたものの，他の研究グループによる先行論文のDNAアプタマー自体が我々の実験条件ではLPAに結合しないことが分かったため，ターゲットの変更等を余儀なくされたためである。今後は異なる株のがん細胞等で調査を進める予定である。
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| Strategy for Future Research Activity |
今後は，昨年に引き続き細胞の表面に発現した特定の分子を選択的に認識するアプタマーの選抜に挑戦する。また，一回の選抜で得られる膨大なDNA配列情報は，それ自体がアプタマー情報を含むビッグデータである。通常の選抜法と異なり，PCR操作によるバイアスや非結合型DNAの混入が少ない本法で得られる配列情報から，アプタマーの性能を予測する手法および細胞表面に結合するアプタマー配列のデータベース化が可能であると考え，それらのデータマイニング法や選抜における選択則と配列情報の関係性を調査する予定である。
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| Causes of Carryover |
理由）本年度後半に，購入予定だったレーザーの寿命が尽きただけでなく，CE装置自体にも故障があり，大幅な修理や買い替えが必要となったため，機種選定等を本年度に行っていたため，予算使用計画に遅れが生じた。30年度前半にこれらに対応する予定である。また，日本国内開催の国際学会に出席し，海外で開催の国際学会参加を次年度とした。これらの理由のため次年度使用額が生じた。
使用計画）本年度前半にレーザーおよびCE装置の修理と買い替えを行う予定である。予算が足りなくなることも想定されるが，校費等でまかなう予定である。
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