2017 Fiscal Year Research-status Report

超分子複合体の形成過程追跡のための温度・圧力制御型電気泳動法および解析法の開発

Research Project

Project/Area Number	16K05814
Research Institution	Gifu University
Principal Investigator	石黒亮岐阜大学, 工学部, 助教 (20293540)
Co-Investigator(Kenkyū-buntansha)	藤澤哲郎岐阜大学, 工学部, 教授 (10231565)
Project Period (FY)	2016-04-01 – 2019-03-31
Keywords	分析化学 / 電気泳動分析 / 超分子化学 / タンパク質複合体
Outline of Annual Research Achievements	本研究の目的は、独自に開発した高圧力電気泳動装置を用い、高圧力によるタンパク質複合体の解離・会合平衡の摂動をポリアクリルアミドゲル電気泳動（PAGE）分析によって定量する方法論の確立である。研究実施計画に従い、様々な圧力下におけるPAGE分析をおこない、タンパク質の圧力による解離現象の観測を試みた。タンパク質複合体試料として、らせん会合体を形成する微生物(Rhodococcus rhodochrous J1)由来のニトリラーゼを組み換え大腸菌より発現・精製して使用した。平成28年度の研究により、50 mMカリウム－リン酸緩衝液を用いた大気圧におけるPAGE分析において2、6、12量体の会合種が観測できたため、同じ溶媒条件、様々な温度・圧力においてPAGE分析をおこなった。その結果、温度の増加に伴って2 量体の割合が減少し、6, 12量体が増加したことから、会合が進行したことが示された。対照的に、圧力を増加させるとわずかな解離現象が観測された。これらは本研究室における様々な温度・圧力におけるX線小角散乱実験より得られた傾向と一致している。しかし、副反応として圧力による凝集が起こり、また温度が高いほど凝集が起こる圧力は低下した。圧力解離を定量的に解析するためには、できるだけ大きな解離度の変化を、できるだけ広い圧力範囲で定量的に観測する必要がある。ニトリラーゼの場合、解離を観測するためにはより高い温度で大気圧における会合を進行させておく必要があるが、上述のように高い温度は圧力による凝集を引き起こしてしまう。これはPAGE分析に必要な低イオン強度の溶媒条件において、ニトリラーゼが凝集しやすいためと考えられ、高圧力電気泳動の方法論開発のための標準試料としては扱いが困難な試料であることが分かった。
Current Status of Research Progress	Current Status of Research Progress 3: Progress in research has been slightly delayed. Reason 本研究の目的は、らせん会合体を形成するニトリラーゼを試料として用い、高圧力によるタンパク質複合体の解離・会合平衡の摂動を高圧力下ポリアクリルアミドゲル電気泳動（PAGE）分析によって定量する方法論の確立である。研究実施計画では、平成29年度には高圧力下におけるニトリラーゼのPAGE分析をおこない、データを収集することとしている。 PAGE分析によればニトリラーゼは大気圧下で2、6、12量体として存在し、圧力増加によって2量体は増加し、6、12量体は減少したことから、解離が起こったことが確認できた。しかし、副反応として凝集が観察されたため、圧力解離の熱力学的解析には至らなかった。高圧力下PAGE分析では圧力平衡化中にゲル上部での試料の濃縮が起こるため、副反応として解離成分の凝集が起こったと考えられ、実験条件の最適化には溶媒のpHや試料濃度などの検討が不可欠であることが分かった。しかし、PAGE分析では溶媒のイオン強度を低めに設定する必要があるが、ニトリラーゼの会合はイオン強度が高いほど会合が進行するため、電気泳動で会合を観測することが本来困難な試料であることなどを考慮すると、高圧力下PAGE分析の実験条件をニトリラーゼに対して最適化することは建設的ではないと考えた。そこで、実験計画を変更し、過去に圧力解離に関して報告がなされている幾つかのタンパク質を標準試料として、高圧力下PAGE分析の実験条件を試料毎に最適化することにした。そのため、平成30年度に計画していた計算機シミュレーションは困難となった。しかし、このような試料毎の実験条件の探索は、将来的に高圧力下PAGE分析を運用するためには不可欠であり、本研究でその方法論を蓄積することは非常に重要である。現在、ブタ心臓由来乳酸脱水素酵素（4量体）を試料に用いた実験条件の探索を勧めている。
Strategy for Future Research Activity	平成29年度のらせん会合体ニトリラーゼの高圧力下ポリアクリルアミドゲル電気泳動（PAGE）分析では、高圧力による会合体の解離が観測されたが、副反応として解離成分の再凝集が見られた。このような現象は他のタンパク質試料においても起こり得るため、試料毎に実験条件を最適化することが必要である。そこで今年度は、過去に圧力による解離が報告されている複数の会合性タンパク質を標準試料として用い、高圧力下PAGE分析の実験条件を試料毎に最適化する。標準タンパク質には市販の酵母エノラーゼ、ウサギ筋肉グリコーゲンホスホリラーゼ、ブタ心臓乳酸脱水素酵素を用いる。これらの試料に対して緩衝液系、試料の添加量、温度等の実験条件を変えつつ高圧力下におけるPAGE分析をおこない、会合種間の分離がよく、かつ凝集などの副反応が起こらず、圧力による解離過程が観測しやすい実験条件を探索する。緩衝液系としてはアルカリ性のTris Glycineや中性のBis-Tris Tricine等の一般的な不連続緩衝液系の他、様々な緩衝剤からなる連続緩衝液系を用いた場合との比較をおこなう。また、金属キレート剤や還元剤などの添加剤などの影響を調べる。これらを通して、任意のタンパク質試料に対して高圧力下PAGE分析を適用する場合の実験条件の最適化手順についての知見を集積する。また、それぞれの試料に対して得られた結果より、圧力によるかい離過程を観測し、さらに定量的な解析によって平衡定数、自由エネルギー等の各種熱力学量を算出する。上述の標準試料はいずれも高圧力下における分光学的手法によって各種熱力学量が報告されているため、それらと比較することによって、高圧力下PAGE分析の信頼性、汎用性、問題点等について検討する。