2018 Fiscal Year Annual Research Report
Development of Temperature- and Pressure-Regulated Electrophoresis Method and Analysis for the Study of Protein Supramolecular Complex Formation
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16K05814
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| Research Institution | Gifu University |
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Principal Investigator |
石黒 亮 岐阜大学, 工学部, 助教 (20293540)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
藤澤 哲郎 岐阜大学, 工学部, 教授 (10231565)
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| Project Period (FY) |
2016-04-01 – 2019-03-31
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| Keywords | 分析化学 / 電気泳動分析 / 超分子複合体 / タンパク質複合体 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
本研究の目的は，独自に開発した高圧力電気泳動装置を用い，高圧力によるタンパク質複合体の解離・会合平衡の摂動をnativeポリアクリルアミドゲル電気泳動(native PAGE)分析によって定量する方法論の確立である。研究実施計画ではらせん会合体を形成する微生物由来ニトリラーゼの圧力による解離を観測する予定であったが，昨年度までの結果より実施が困難であることがわかった。そこで，過去に他の手法を用いて高圧力による解離が報告されているブタ心臓由来乳酸脱水素酵素(LDH)4量体に対して高圧力native PAGE分析をおこない，泳動条件や解析方法の最適化をおこなった。
過去の研究と近い溶媒条件で25 ℃におけるLDHの高圧力native PAGEをおこなったところ，主バンド#1と副バンド#2が観測され，泳動速度のゲル濃度依存性の解析(Ferguson plot)によってそれぞれ4量体と解離状態（2または単量体）に帰属された。また，60 MPaまでの圧力の上昇に伴って#1の減少および#2の増加が観測され，LDH 4量体が圧力によって解離することが示された。一方，70 MPa以上での高圧力では凝集反応が観測された。
次に印加電圧を110～310 Vに変化させることで泳動速度を変えて同様の実験をおこなったところ，泳動速度の増加によって各成分比率が変化し，#2が二つの成分からなる複合バンドであることが分かった。この成分比率の変化は泳動中の再解離・再会合による平衡組成からのずれに対応すると考えられ，泳動速度無限大の条件への外挿によって平衡組成を見積もることが可能になった。
以上のように，高圧力native PAGE分析において，ゲル濃度および泳動速度を系統的に変化させる実験手法が，タンパク質複合体の解離・会合平衡の定量的解析に有効であることが分かった。
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