2016 Fiscal Year Research-status Report
核酸の自発的連鎖反応を利用した高感度腫瘍細胞検出法の開発
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16K05819
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| Research Institution | Kumamoto University |
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Principal Investigator |
北村 裕介 熊本大学, 大学院先端科学研究部(工), 助教 (80433019)
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| Project Period (FY) |
2016-04-01 – 2019-03-31
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| Keywords | アプタマー / 血中循環腫瘍細胞 / 細胞捕捉 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
がんが進行すると、一部の腫瘍細胞が原発腫瘍細胞組織から剥離し、血液やリンパ液の流れに乗り、体内の別の臓器に移動することで癌の転移が起こる。このように血流に乗って体内を循環している腫瘍細胞は、血中循環腫瘍細胞（Circulating Tumor Cell: CTC）と呼ばれている。単位血液量中に含まれるCTC数は、がんの悪性度や術後の生存期間に強い相関が認められており、近年、新たながん診断マーカとして注目されている。本研究では、多くの固形癌種の細胞膜上に過剰発現している膜タンパク（EpCAM）に対するアプタマーを金基板表面に修飾し、これを用いてCTC等のがん細胞の特異的捕捉及び高感度検出を目的とした。アプタマー修飾金基板上でがん細胞（MDA-MB-453、MCF-7：ヒト乳癌細胞、KATOIII：ヒト胃癌細胞）と正常細胞（HEK293T：ヒト胎児腎細胞）の捕捉数を比較し、特異的にがん細胞を捕捉可能な基板修飾法の検討を行った。金基板表面に末端チオール化アプタマーを金－チオール結合にて修飾した。その後、基板への非特異的な吸着を抑制するために、残余表面を6-メルカプト-1-ヘキサノールで修飾し、SAM膜を形成した。修飾基板上に 染色したがん細胞（核をDAPIで、膜をDiOで染色）、正常細胞（核をDAPIで、膜をDiDで染色）を加え、一定時間インキュベートした。洗浄後、顕微鏡で観察し、細胞数を比較した。結果、がん細胞が選択的に捕捉されることがわかった（MDA-MB-453: 43 cell/mm2、MCF-7: 54 cell/mm2、KATOⅢ: 22 cell/mm2、HEK293T: 6 cell/mm2）。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
細胞捕捉基板の最適化が順調に進行した。
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| Strategy for Future Research Activity |
本研究における腫瘍細胞検出システムの概要は以下のとおりである。１、細胞の非特異的な吸着を抑制するために、まず、金基板上にポリエチレングリコール誘導体 SAM 膜を形成させた後、その上に EpCAMアプタマーを修飾する。２、サンプル溶液(例えば腫瘍細胞を含む血液)を修飾基板上に滴下 し、腫瘍細胞を選択的に捕捉する。３、洗浄後、タグ付けしたアプタマーを、捕捉した細胞に結合さ せる。再度洗浄後、シグナル増幅のトリガーとなる一本鎖(トリガーDNA)とその相補鎖(マスク DNA) から成る二本鎖(ケージドトリガー。タグに応答して解離し、トリガーDNA を放出する)とプローブ の混合溶液を滴下する。４、放出されたトリガーDNAがプローブに作用し、シグナルが増幅される。
トリガーDNA とマスク DNA 二本鎖が形成する二本鎖は突出した一本鎖領域(toehold)を有してお り、これをきっかけとし、鎖交換反応が起こり、タグ付きアプタマーのタグの部分とマスク DNA がより、安定な二本鎖を形成し、結果、トリガーDNA が放出される。放出効率の最適化時には、まずは細胞を用いず、蛍光色素ラベル化トリガーDNA と消光剤修飾マスク DNA から形成される二本鎖に対し てタグ付きアプタマーを添加し、蛍光回復量、速度からトリガーDNA の放出効率を評価した。トリガ ーDNA/マスク DNA 二本鎖の toehold 長がトリガーDNA の放出に最も影響を与えると考えられるため、 これを微調整し、最適化した。また、温度や塩濃度などのパラメーターも最適化した。今後は、細胞上でDNAサーキットを動作させていく予定である。
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| Causes of Carryover |
熊本地震による研究進行の遅延。
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| Expenditure Plan for Carryover Budget |
購入予定のものに変更はないため、研究の進行と共に使用していく予定である。
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