2016 Fiscal Year Research-status Report
タンパク質・細胞インタラクション電子伝達性アミノ酸配列組込みプローブの構築
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16K05820
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| Research Institution | Maebashi Institute of Technology |
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Principal Investigator |
菅原 一晴 前橋工科大学, 工学部, 教授 (30271753)
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| Project Period (FY) |
2016-10-21 – 2019-03-31
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| Keywords | 分子認識ペプチド / 電子伝達性ペプチド / 細部センシング / ドラックデリバリー / 細胞膜透過性ペプチド |
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| Outline of Annual Research Achievements |
1. 細胞膜透過性/アポトーシス誘起/電子伝達性ペプチドを合成し、ペプチドの電極応答の変化からU937細胞のセンシングを行う新たなシステムを考案した。この多機能性ペプチドはU937細胞膜を選択的透過してアポトーシスをもたらすプロテグリンの配列の一部をアルギニン残基に置換し、電子伝達性ペプチドをそのC-末端に導入したものである。その特性として、プロテグリン/電子伝達性ペプチドに比較し作製したペプチドでは細胞膜透過性が向上しており、U937細胞の検出感度を改善することができた。また、本ペプチド配列は抗がん剤としての働きを有しており、ドラッグデリバリーとしての応用が期待され、細胞膜透過性の評価法としても重要である。
2. オボアルブミン（OVA)の電気化学的センシングするためにOVA分子認識/電子伝達性ペプチドを固定化したマイクロ磁性ビーズを設計した。そのねらいは、OVAと上記ペプチドとの相互作用に基づき高感度でありつつビーズの再生使用が容易なOVA検出ツールを構築することであった。その結果、 ビーズ表面上の電子伝達性ペプチドが電極表面と接触することで酸化応答が得られることを見出した。また、OVAがビーズに濃縮されるために、その電極応答が減少を測定することで10－13 Mレベルの検出を可能とした。 一方、使用したビーズをタンパク質変性剤で処理することで再利用をすることも可能であった。血清においてOVAの添加回収実験を行ったところマトリックスからの影響も少なく、優れたOVAセンシングツールを開発することができた。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
細胞膜透過性/アポトーシス誘起/電子伝達性ペプチドプローブによるU937細胞のセンシングに関しては、電子伝達性ペプチドの新たな特性が明らかとなり蛍光プローブに劣らない測定感度を有するものである。その有用性としては、細胞膜外のペプチドプローブを分離する操作が不要であるという利点をもつ。また、提案したペプチド配列のアルギニン残基の導入数と細胞膜透過性につても有益なデータを取得した。一方で、アポトーシス誘起ペプチドと電子伝達性ペプチドとの組み合わせは新規性が高く、プローブすべてアミノ酸で構成されていることも医学的分野にも波及効果が高い。さらに、細胞へのドラックデリバリーのモニタリング法として興味深い知見が得られており初年度の結果としては評価できるものと考える。
マイクロ磁性ビーズ表面上にオボアルブミン（OVA)分子認識/電子伝達性ペプチドを修飾したツールによるOVAの検出に関する研究については、タンパク質のビーズへの濃縮効果を利用し高感度化を試みた。すでに、均一反応でのオボアルブミン―ペプチドプローブ間相互作用によるターゲットタンパク質の測定については報告しているが、今回の研究で測定感度を一桁向上させることに成功した。加えて、実試料における共存物の干渉を測定の溶液を交換しることで除去できる可能性をもっている。先に述べたが、タンパク質を変性させることでビーズに固定化されたペプチドからの除去ができ、再利用の特性を持っている。この視点からもタンパク質のセンシング法としての新たなアプローチとなるといえる。以上、本年度の成果から判断しておおむね順調と判断した。
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| Strategy for Future Research Activity |
本年度の成果を基礎として、単純タンパク質と糖タンパク質との糖鎖に基づいた分子認識機構によるターゲットタンパク質のセンシングシステムについて取り組む予定である。例えば、糖タンパク質の表面に電子伝達性ペプチドを修飾したプローブを作製し、その糖鎖認識タンパク質との結合による電気化学的検出を予定している。その修飾方法としては、タンパク質のN-末端あるいはC－末端に電子伝達性ペプチドを導入することでプローブとしての機能を有することが期待できる。または、親水性のリシン残基のアミノ基やグルタミン酸などのカルボキシル基を利用する手法も考えられる。修飾プローブの分離にはヒスタグなどの用いることもありうる。ターゲットタンパク質としてはガラクトース部位と結合するガレクチンファミリーを対象としたい。基礎的検討を行う際には、大豆由来レクチンをモデルすして評価するものである。
マイクロビーズを支持体として擬似糖質ペプチドの固定化も行い、ビーズ表面でのタンパク質－擬似糖質ペプチド間相互作用をモニタリングする。この場合、擬似糖質ペプチドの配列にはチロシン残基が複数含まれるものであり、これまでに報告した電子伝達性ペプチドの構成アミノ酸残基と多分に配列が類似したペプチドである。それゆえ、そのペプチドは擬似糖質電子伝達性ペプチドとなり分子認識部位自体が酸化応答を示すものとなりラベリングが不要となるシンプルな測定系を構築する。さらに擬似糖質電子伝達性ペプチド修飾ビーズと細胞表面の糖鎖を糖質認識タンパク質に対して競争反応させることで、細胞表面に糖鎖の探索に応用できる可能性をもっている。
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| Causes of Carryover |
タンパク質およびペプチド、生化学試薬の購入を予定しおり申請していたが、使用量が想定よりも少量であったこと、購入金額が若干低価格であったことがあげられる。また、採択していただいた時期が10月であったため、若干予算の使用にずれがあった。
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| Expenditure Plan for Carryover Budget |
次年度分として、タンパク質やペプチド、マイクロビーズなどの購入にあて、多面的に研究課題を進めていく予定である。
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