2017 Fiscal Year Research-status Report
ペプチド核酸を利用した転写因子関連タンパク質の新規解析法の開発
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16K05825
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| Research Institution | Tokyo University of Technology |
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Principal Investigator |
須磨岡 淳 東京工科大学, 工学部, 教授 (10280934)
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| Project Period (FY) |
2016-04-01 – 2019-03-31
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| Keywords | 転写因子 / 核酸 / ペプチド核酸 / DNA切断 / セリウム |
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| Outline of Annual Research Achievements |
これまで，長鎖DNAから所定のDNA断片を切り出す化学ツールとして，長鎖ターゲット配列へインベージョンする人工核酸であるpseudo-complementary peptide nucleic acid (pcPNA)と一本鎖特異的なDNA切断酵素（S1ヌクレアーゼなど）の組み合わせ，あるいはpcPNAと我々の見いだした一本鎖DNA切断触媒であるCe(IV)/EDTAの組み合わせのいずれかを用いてきた．しかし，本研究の転写因子関連タンパク質の解析目的には，その選択性や切断活性をさらにもう一段階向上させる必要があることが明らかとなってきた．昨年度に引き続き，新たなDNA切断触媒の開発を中心として研究を進めたところ，セリウム酸化物のナノ粒子が，リン酸ジエステル結合（DNAのモデル化合物としてビス(4-ニトロフェニル)リン酸を使用）に対して，加水分解活性を有することが明らかとなってきた．さらに，調製法の異なる酸化セリウムナノ粒子や市販の酸化セリウムナノ粒子について活性を比較したところ，調製法の違いによりその加水分解活性が異なることが明らかとなった．さらに，最もリン酸エステル加水分解活性の高かったナノ粒子を用いてDNA（プラスミドDNA，pBR322を使用）の切断活性を検討したところ，プラスミドDNAの断片化が確認された．Ce(IV)/EDTAの均一系と比較するとナノ粒子の系は，DNA切断後の触媒の分離が容易であることが期待されることから，本系を用いたDNA切断のシステムをキット化していくことなどについても今後検討を行っていく予定である．
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
3: Progress in research has been slightly delayed.
Reason
本研究の転写因子関連タンパク質の解析目的には，DNA切断のための化学ツールの選択性や切断活性をさらにもう一段階向上させる必要があることが明らかとなってきた．本年度はこの点を解決すべく研究を実施した．そのため，アフニティー分離条件についての最適化に関して進捗にやや遅れが生じているが，ゲノムDNA（核から抽出したゲノムからDNA結合タンパク質などを精製キットなどで取り除いたDNA）を用いて，アフィニティー精製についての検討を行った．今後，モデルタンパク質やゲノムそのものなどのタンパク質共存下でのDNA切断や切断断片精製条件の検討に注力する予定である．研究体制そのものは徐々に整ってきており，今後十分な成果が得られると考えている．
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| Strategy for Future Research Activity |
アフィティー分離条件についての最適化に関する検討については，タンパク質不在下での検討は29年度に一部実施することができた．しかし，タンパク質共存下におけるアフィニティー分離，さらにはタンパク質が「固定化されたモデルDNA」からの所定の「DNA―タンパク質複合体」を精製してくる条件の最適化などについての検討を30年度の早期に実施する．また，より生きた細胞の状況に近い分子クラウディングな環境におけるpcPNAのdouble-duplex invasion条件についての検討を行い，研究期間内に本研究課題で提案する化学ツールを用いた転写因子の新規解析手法の有用性を実証することを目指す．
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| Causes of Carryover |
酵素などに関しては使用期限が厳密に決まっており，研究の進展に従い使用する直前に購入する方が合理的であることから，相当する額を次年度に繰り越すことにした．
基本的には当初の計画に従い，消耗品（種々の試薬類・酵素類・分析関連試薬）の購入に使用する．
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