2016 Fiscal Year Research-status Report
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16K05827
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| Research Institution | Ryukoku University |
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Principal Investigator |
宮武 智弘 龍谷大学, 理工学部, 教授 (10330028)
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2016-04-01 – 2019-03-31
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| Keywords | リポソーム / 酵素 / 酵素阻害剤 / 蛍光センシング / 膜透過性ペプチド |
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| Outline of Annual Research Achievements |
医薬品の開発等に不可欠な酵素および酵素阻害剤の活性評価を、従来法よりも簡便、迅速かつ高感度に行える全く新しい蛍光検出型の分析手法を開発する。ここでは、カチオン性のペプチドがリポソームの脂質二分子膜を透過する現象を応用して、酵素反応溶液中の基質の濃度変化を蛍光強度の変化として検出する。こうして酵素反応を可視化し、その活性評価を容易にするラベルフリーな分析系を構築する。本研究では、さらに低濃度で作用する膜透過性ペプチドを創製することで低濃度の分子を検出できるよう改良し、酵素評価法の感度を向上させ、既法よりも少ない酵素量で検出できる優位性の高い分析法の確立を目指す。そして、本研究期間内に、癌治療にも関係するリン酸転移酵素（キナーゼ類）の活性評価系を確立し、その高感度分析を実現させることを目標とする。
これまでの研究から、カチオン性のオリゴアルギニン類は、表面電荷が負である脂質二分子膜と相互作用しやすく、アニオン性の両親媒性分子との複合化により疎水性基が付与されると、容易に脂質二分子膜を透過できることが確認されている。今年度の研究では、①ペプチドの膜透過に大きく寄与する疎水性置換基であるピレンを、カチオン性のオリゴアルギニンに共有結合を介して導入した新規膜透過性ペプチドの合成、②膜透過性ペプチドと酵素キナーゼの基質であるATPとの相互作用による膜透過活性の変化、について調べ、酵素活性評価に必要なペプチド材料の合成と、その基礎的なデータの収集を行った。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
一般的な固相合成法によりアルギニンを重合させたオリゴアルギニンを合成し、そのN末端にピレン酪酸のカルボキシ基を縮合させることに成功し、予定していたピレンを持つオリゴアルギニンを合成することができた。つぎに、蛍光色素を内封したリポソームにこのオリゴペプチドを添加したところ、速やかに蛍光発光の上昇が確認され、ピレンを導入したオリゴアルギニンは、高い膜透過性を有することを確認できた。さらに、キナーゼの活性評価のための予備的な試験として、本酵素の基質であるATPの存在下で膜透過活性を測定したところ、本オリゴペプチドの膜透過活性は系内に存在するATPの濃度に応答して変化することを確認できた。以上のことから、今年度の研究により、当初計画していた膜透過性ペプチドの合成と、その膜透過活性の確認、さらには酵素活性の評価に適応できること、を実証できた。
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| Strategy for Future Research Activity |
２８年度の研究にて合成・膜透過活性が確認できたオリゴペプチドを用いて、酵素活性の評価を行う。まずは、最も汎用性の高い酵素であるヘキソキナーゼを対象とした試験を行う。つぎに、オリゴペプチドに導入するピレン基の位置や数、あるいはアルギニンの残基数を変えた種々のオリゴペプチドを合成しながら、より低濃度で作用できる膜透過性分子の開発を行う。こうすることで、低濃度の（微量の）基質の濃度変化を検出でき、より高感度な酵素活性評価系の構築が期待できる。また、他のキナーゼ類としてタンパク質を基質とするプロテインキナーゼ、グリセリンを基質とするグリセロキナーゼ、など様々な酵素に対しても試験を行い、本系の汎用性についても調査を実施する。
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