2017 Fiscal Year Research-status Report
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16K05840
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| Research Institution | Tokyo Institute of Technology |
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Principal Investigator |
大窪 章寛 東京工業大学, 生命理工学院, 准教授 (60376960)
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| Project Period (FY) |
2016-04-01 – 2019-03-31
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| Keywords | U1 snRNA / U11 snRNA / スプライシング |
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| Outline of Annual Research Achievements |
本研究課題では変異したスプライスサイトに相補的な配列をもつ人工UsnRNA（今回はU１snRNAやU11snRNA）を化学合成し細胞導入をお こなうことで、スプライシングを正常にもどすことを目的としている。 U１snRNAおよびU11snRNAは５'側のわずか８塩基を使ってイントロンとエキソンにまたがるスプライスサイトを認識する。そこで、 本研究期間内にUsnRNAのこの部分に修飾を加え疾病原因遺伝子の塩基配列変異に対応させるほか、さらなるスプライスサイト認識や核 酸分解酵素に対する耐性の向上をおこなっていく。 これまでに我々は「ホスホロアミダイト化合物を利用した高効率ポリリン酸化反応」を独自に開発し、m3Gキャップ構造を有するオ リゴヌクレオチドの迅速かつ高効率な合成法を報告してきた。また、平成28度までにsplint DNAとT4DNA Ligase を用いた効率の良い長鎖RNAの構築法の開発を行ってきた。
そこで、平成29年度では化学修飾を加えたU1 snRNAアナログの合成とスプライシング活性評価のための嚢胞性線維症モデル細胞の作成を行った。化学修飾基としては、図書の予定通り、核酸分解酵素に非常に高い耐性を示すことN-メチルカルバモイルエチル基や、塩基識別能向上することのできる2-チオウリジンや4-アセチルシトシン、6-アセチル-7-デアザ-8-アザアデノシン、3-デアザ-2-アセチルグアノシンの検討を行っている。また、嚢胞性線維症モデル細胞は、HeLa細胞にCFTRイオンチャンネルのexon12のスプライスサイトが変異したmini geneを導入することで作成することができた。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
平成28年度までに開発したsplint DNAとT4DNA Ligase を用いた効率の良い長鎖RNAの構築法を用いて、複数の化学修飾を有するU1 snRNAを効率よく合成できただけでなく、本年はこれらU1 snRNA活性評価を行うための嚢胞性線維症モデル細胞の作成に成功している。このことから、本研究は当初の計画通りに、順調に遂行できているといえる。
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| Strategy for Future Research Activity |
平成29年度に合成した修飾U1 snRNAのスプライシング活性評価を行い、化学修飾の種類や位置と活性の相関を詳細に調べていく予定である。また、これらの結果を修飾U1 snRNAのデザインにフィードバックし、より高い活性を有する修飾U1 snRNAの開発を行っていく。
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| Causes of Carryover |
当初の計画よりも、若干ではあるが研究が効率よく進み、予定していた複数の実験を省略する事ができたから。（使用計画） 修飾核酸のスプライシング活性評価の回数を当初の計画より増やす事で、本研究の再現性向上につなげていく予定である。
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Research Products
(4 results)
