2017 Fiscal Year Research-status Report
サーマルプログラミングによる蛋白質ナノブロックの逐次的自己組織化基盤技術の開発
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16K05841
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| Research Institution | Shinshu University |
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Principal Investigator |
新井 亮一 信州大学, 学術研究院繊維学系, 准教授 (50344023)
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| Project Period (FY) |
2016-04-01 – 2019-03-31
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| Keywords | 人工蛋白質デザイン / タンパク質ナノブロック / 蛋白質工学 / 蛋白質安定性 / X線結晶構造解析 / ナノバイオテクノロジー / 超分子化学 / 自己組織化 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
これまでに、独自のヌンチャク型二量体を形成する新規人工タンパク質WA20と3量体を形成するT4ファージ由来のfoldonドメインを組み合わせたWA20-foldonや、WA20を2個ヘリックスリンカー(HL4)で直列に連結したWA20-HL4-WA20等の蛋白質ナノブロックを開発し、6の倍数量体の多面体型複合体や鎖状複合体など、様々な多量体超分子ナノ構造複合体の構築に成功してきた。そこで、本研究では、複数の温度で可逆的に熱変性・再生する蛋白質ナノブロックを開発し、サーマルサイクラーによる温度変化プログラミングにより逐次的に自己組織化させるための基盤的技術を開発することを目的とした。
今年度は、これらの異なる変性温度で可逆的に熱変性・再構成する自己組織化蛋白質ナノブロックの開発を目指して、一つの分子内に変性温度の異なるドメインを持つ鎖状蛋白質ナノブロックを構築した。Native PAGEを行うと各サンプルともラダー状に複数のバンドが見られ、複合体形成が示された。次に、熱変性・再構成実験を行うとバンドパターンが変化した。また、加熱CDスペクトル測定の結果、SUWA-HL4-WA20とWA20(V71L)-HL4-WA20の各Tmは、それぞれWA20とSUWAの間のTm、WA20とWA20(V71L)の間のTmを持つことが分かった。また、サイズ排除クロマトグラフィー－多角度光散乱(SEC-MALS)実験の結果、1～6量体を形成しており、変性温度の異なるドメイン間の異種会合も起こっていることが示唆された。さらに、これらの蛋白質ナノブロックの溶液中での分子サイズと概形構造を調べるために、加熱前後のサンプルについてサイズ排除クロマトグラフィー(SEC)と小角X線散乱解析(SAXS)を組み合わせたSEC-SAXS実験を行った。その結果、加熱の前後で分子サイズの分布が変化することも示唆された。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
研究実施計画において予定していた、異なる変性温度で可逆的に熱変性・再構成する自己組織化蛋白質ナノブロックを開発する実験はおおむね順調に実施することができた。これまで得られた研究成果についていくつかを取りまとめて、現在論文を執筆中である。また、予想以上の興味深い実験結果も得られてきているため、今後、新たな展開や発展的な取り組みも検討していきたい。
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| Strategy for Future Research Activity |
異なる変性温度で可逆的熱変性・再生する蛋白質ナノブロックを開発し、サーマルプログラミングにより逐次的に自己組織化する基盤技術を開発する蛋白質ナノブロックによるナノ構造構築技術の高度化の目的を達成するため、今後さらに、異なる変性温度で可逆的に熱変性・再構成する自己組織化蛋白質ナノブロックの開発や、サーマルプログラミングによる蛋白質ナノブロックの逐次的自己組織化ナノ構造構築及び構造解析を進めて、研究を推進する予定である。また、ゲルろ過クロマトグラフィー(SEC)により特定のナノ構造成分を精製し、多角度光散乱(SEC-MALS)分析による絶対分子量測定、小角X線溶液散乱法による低分解能構造解析、及びX線結晶構造解析による高分解能立体構造解析に取り組む。さらに、透過型電子顕微鏡や原子間力顕微鏡によって、巨大な超分子複合体構造や会合ネットワーク構造等を可視化・観察も試みる予定である。
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| Causes of Carryover |
今年度は、現有や共有の設備や余剰の消耗品・試薬等を活用して研究を進めて、研究費の効率的な使用に努めた結果、費用対効果の高い成果を上げることができたと考えられる。また、いくつか想定外の興味深い実験結果も見られたため、それらの結果をさらに深く追究して新たな実験系などを検討するのにある程度の時間が必要であった。今後、次年度使用額を用いて、新たな試薬等の購入も予定しており、また、多くの学会発表や論文発表を積極的にする予定であり、学会参加費・旅費や、論文掲載料等にも充てる予定である。
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