2018 Fiscal Year Research-status Report
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16K05843
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| Research Institution | Kyoto University |
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Principal Investigator |
坂口 怜子 京都大学, 高等研究院, 特定助教 (80723197)
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| Project Period (FY) |
2016-04-01 – 2020-03-31
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| Keywords | 神経分化 / シグナル伝達 / 一酸化窒素 / 機能性材料 / 細胞応答制御 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
神経細胞は複雑なネットワークを形成し、細胞同士で情報をやり取りすることで生命活動を司っている。しかし、遺伝的・後天的要因によりこのネットワークに異常が起きると、情報伝達が正常に機能しなくなり、神経疾患の原因となり得る。一酸化窒素（NO）は、神経ネットワークの形成に関与する様々な因子の内の一つであると考えられている。生体ガス分子の中でもNOは多くの研究例が存在し、特に、血管拡張や免疫系での研究は進んでいるが、より局所的な制御が必要な神経系での研究はあまり進んでおらず、その作用について詳しい分子機構は明らかになっていない。
本研究では気体分子であるNOの細胞内シグナル分子としての役割を解明するとともに、人工的な神経ネットワーク形成制御を実現するために、マウス由来の神経様細胞などを用いて、新規に開発された光応答性NO放出材料（NOF）に対する応答を評価している。前年度までに、神経細胞突起のNO依存的な収縮応答が観察された。本年度はこの応答の機構解明を目的に、NOの標的になり得るチャネル等に対して種々の阻害実験を行ったが、この応答を引き起こすNO受容体の同定には至っていない。
本年度はさらに、NOと同様に一酸化炭素（CO)を放出する材料の提供を受け、これを用いてCO存在下の細胞応答の評価を試みた。生体内でCOは、数百ppm程度の低濃度で、炎症の抑制効果などを発揮することが知られている。現在までに、HeLa細胞を用いた試験で、この材料は細胞毒性を示さず、細胞の増殖能にも影響を及ぼさないことが確認できた。
本研究に関連して、以下の学会発表を行った。
1. Reiko Sakaguchi et al., “TRPC5 channel-Caveolin-1-eNOS signalplexes coordinate interplay between Ca2+ and NO signals in endothelial cells”. 18th World Congress of Basic and Clinical Pharmacology, July 3rd, 2018.
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
3: Progress in research has been slightly delayed.
Reason
当初の研究計画では、本年度はNOによる修飾の標的となるタンパク質の分子実体を同定までを完了する予定であった。NO感知の分子実体を同定するために、NOによって修飾され、開閉が制御されることが知られている数種類のカルシウムイオンチャネル、クロライドイオンチャネルなどの標的候補に対して阻害剤を投与したが、応答に変化は見られず、NO受容体の同定に至っていない。理由として、本研究計画は当初、申請者のエフォート４０％で開始し、2年目までは順調に進行していたが、それ以降、他の研究プロジェクトが複数採択され、それぞれの研究代表者・研究分担者として業務が多忙となり、本研究のエフォートを減らさざるを得なかったことが挙げられる。従って、研究計画が遅延した。また、平均的な産仔数と育児成功率に基づいて実験計画を立てたマウスが産仔の食殺を繰り返し、繁殖成績が悪かったことも計画の遅延の原因となった。以上の点から、やや遅れていると考えられる。
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| Strategy for Future Research Activity |
本研究では、前年度までに、ラット由来神経様細胞の神経突起のNO依存的な収縮応答が観察されている。生体内において、NOは一酸化窒素産生酵素（NOS）によって産出され、標的分子と反応するが、その反応性の高さから、生体内に存在する様々な分子と化学反応を起こすため、標的の付近でNOが産出できるようにNOSの空間的制御が重要である。この制御メカニズムを探索し、その機能欠損をNOFで代替できるシステムを構築する。
この制御メカニズムとして、細胞内にはNO を感知する分子が発現しているはずである。最終年度は、引き続きこのNO が作用するターゲット分子を探索し、NO による神経細胞応答の分子メカニズムを解明する。これまでの結果から、細胞内に発現している複数のイオンチャネル群は、神経突起のNO応答に直接関与していないことが明らかにできているため、細胞の成長応答のシグナル伝達に関与していることが知られているリン酸化酵素や、NOSとの相互作用が知られるタンパク質などを標的候補として評価する。また、神経のシナプス上には多数のミトコンドリアが存在することから、NO検出の分子実体がミトコンドリアに発現している可能性も考えられる。NOによって神経突起の長さが変化する条件下で、ミトコンドリア画分のみを抽出してここに発現しているタンパク質を生化学的な手法で検出し、各種の阻害剤・活性化剤を用いて応答の変化を確かめることで、NO検知に重要な分子実体の存在を評価する。
当初の研究計画ではNOFの評価のみを想定していたが、COを放出する材料も新たに提供されたため、次年度はさらに、CO放出材料を使ったCOの生理学的重要性の探求も試みる。2種類の異なるガス状シグナル分子であるNO, CO双方の細胞内での働きについて評価し、両者の協同的な作用の可能性を探る。以上の知見から、将来の「ガスの薬」創製に向けての技術確立に向けて研究を展開する予定である。
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| Causes of Carryover |
細胞培養皿、培地、血清、試薬類などは研究遂行に必須であるが汎用性の高い消耗品でもあり、これらの購入にあたり、所属している研究室や、共同研究先で進行している他の研究課題で使用する分と共に一括購入した。そのため共有効果で単価が下がり、当初予定していた予算より安い価格で購入する事が出来たため、余剰が生じた。その一方で、他の研究プロジェクトが複数採択され業務が多忙となり、本研究のエフォートを減らさざるを得なかったため、研究計画がやや遅延した。その結果、次年度使用額が生じた。この分は、マウスの繁殖成績を高めるための飼育費や、感度の良い抗体の購入などに使用する計画である。
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Research Products
(2 results)
