2016 Fiscal Year Research-status Report
Preparation of novel nanodiscs that allow to in site analysis of membrane proteins
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16K05860
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| Research Institution | National Institute of Advanced Industrial Science and Technology |
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Principal Investigator |
井村 知弘 国立研究開発法人産業技術総合研究所, 化学プロセス研究部門, 研究グループ長 (10371022)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
保坂 俊彰 国立研究開発法人理化学研究所, ライフサイエンス技術基盤研究センター, 研究員 (40462725)
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| Project Period (FY) |
2016-04-01 – 2019-03-31
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| Keywords | ナノディスク / 膜タンパク質 / 両親媒性ペプチド / 界面活性剤 / 可溶化 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
親水/疎水バランスの異なる21残基の各種ペプファクタント（PF）を設計・合成した。疎水面の中央に各種アルキル鎖が導入されたペプファクタントの合成を試みた。その結果、９残基目に導入したシステインの側鎖と予め合成した2-ヨード-N-オクチルアミドを緩衝液中で反応させることによって、オクチル基が導入されたペプファクタントを収率70%で合成することに成功した。アルキル鎖の異なる数種類のペプファクタントも合成するとともに、それらの構造については、NMR測定やMALDI-TOFMS測定により同定した。
得られた各種ペプファクタントを用いたナノディスクの調製と膜タンパク質の封入を試みた。モデル膜タンパク質として無細胞合成系によりDMPCリポソーム中に発現させたカサノリ由来ロドプシン（ARⅡ）を用いたところ、ペプファクタントの添加によりリポソームの溶液の濁度は短時間で大幅に低減された。また、ネガティブ染色透過型電子顕微鏡（NS-TEM）でその構造を確認したところ、多数のナノディスクが形成することが明らかになった。動的光散乱法（DLS）により粒子径を計測したところ、12nm程度のサイズであった。またサイズ排除クロマトグラフィー（SEC）により、得られたナノディスク中にARⅡが存在することを確認することもできた。紫外・可視スペクトル（UV）測定等により、ARⅡがナノディスクの膜環境中で活性を維持していることも明らかになった。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
親水/疎水バランスの異なるペプファクタント（PF）の合成については、基質への溶解性や反応条件の最適化などが当初の予定より困難であったが、目的のペプチドを合成することに成功した。また、予めアルキル基が導入されたシステインを合成した後に、ペプチド固相合成を行うことで収率も改善された。
カサノリ由来ロドプシン（ARⅡ）のナノディスクへの封入については、リン脂質の選定や最適組成の検証が順調に進捗して、当初の目的通り、その活性を維持したままナノディスク中に封入することが可能となった。
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| Strategy for Future Research Activity |
得られたペプファクタントの詳細な物性を明らかにしていくとともに、膜タンパク質の封入に最適なナノディスクを作り出すことに注力していきたい。また、ナノディスク中に内包された膜タンパク質の機能解析を実施することも鍵となり、透過型電子顕微鏡（TEM）やNMRで直接観察可能なAcrB等のモデル膜タンパク質を用いて研究を推進する。
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| Causes of Carryover |
新規ペプファクタントの合成において、当初の予定よりも条件の最適化が順調に進み、Fmocアミノ酸、縮合剤等に関する使用額が少なかったため。
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| Expenditure Plan for Carryover Budget |
膜タンパク質の機能解析を本格的に進めるにあたり、新規ペプファクタント、膜タンパク質を量産する必要があり、Fmocアミノ酸、縮合剤を含む試薬等に使用する。
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Research Products
(1 results)
