2017 Fiscal Year Research-status Report
ゲノム分子生物学による生存可能な病原性細菌の直接計数法の研究開発
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16K06559
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| Research Institution | Hachinohe National College of Technology |
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Principal Investigator |
矢口 淳一 八戸工業高等専門学校, その他部局等, 教授 (80342450)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
山本 歩 八戸工業高等専門学校, その他部局等, 准教授 (60523800)
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| Project Period (FY) |
2016-04-01 – 2020-03-31
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| Keywords | ｒRNA / 大腸菌 / PMA / PCR / 次世代シーケンサー |
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| Outline of Annual Research Achievements |
平成29年度にはrRNAそのものを使用して、RT-qPCR法の確立による生存可能な大腸菌の定量について検討した。逆転写酵素を用いたRT-qPCR法においてone-step法と２つのtwo-step法を比較したところ、ランダムプライマーを使用したtwo-step法は、低濃度サンプルでも最も感度が良く定量できた。この方法を用いて行った排水と河川サンプルの分析結果では常にRNA濃度がDNA濃度を上回る値を示し、rRNAを利用した計測方法による検出感度改善の可能性が示された。
次世代シーケンサーによる生理的活性のある細菌の細菌叢解析のため、２段階で増幅を行うnested-PCRの効果について検討した。次世代シーケンサーの増幅領域である16S rRNA遺伝子のV3-V4領域について、排水サンプルを用いてPMA処理後PCRとnested-PCRを比較したところ、電気泳動の結果からnested-PCRの方が塩基長約450bpのDNA断片を高い濃度で増幅可能であり、３つの購入株の細菌を使用した実験でもnested-PCRの分別効果が確かめられた。そこで熱処理した排水サンプルに培養した大腸菌と糞便性連鎖球菌を添加して、PCR, PMA-PCR，PMA-nestedPCR, RT-PCRの４手法を比較するため次世代シーケンサーで細菌叢を解析したところ、PCR以外の３つの方法では添加した２菌種を検出できたが、RT-PCRのみ添加量を反映した細菌叢が得られた。nested PCRとPCR法による違いはほとんどなく、これらの結果はβ多様性解析によっても確認できた。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
今年度の研究成果で示したように、次世代シーケンサーによる生理的活性のある細菌の細菌叢解析のための手法はほぼ確立できた。また昨年度BacLight法による直接染色法とPCRやPMA-PCRによる遺伝子増幅法との間で計数値に大きな差異が見られた全細菌を対象としたPMA-PCR法の研究開発では、プライマーの改変とDNA抽出方法の改善を行ったところ、リアルタイムPCRとBaclight法による河川サンプルの全細菌の計測は、どちらの方法でも細菌濃度がおよそ10^(7);個（copy数）/ml以上となった。また、ろ過濃縮によって細菌が死滅するという問題点もあったが、BacLight法による生菌染色では死菌と判定されていても、ろ過後に大腸菌を培養してDVC法で確認したところ、ほとんどの細胞が活性があり、ろ過濃縮によって細菌は死滅するわけではないことがわかった。従ってろ過濃縮した細菌がPMA試薬で染色されないように工夫すれば、ろ過操作が必要な細菌濃度の低いサンプルでもPMA-PCR法の適用が可能と考えられる。
このように次世代シーケンサーによる細菌叢解析のための手法と全細菌の計数法はほぼ確立できたので、研究はおおむね順調に推移していると判断される。
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| Strategy for Future Research Activity |
平成30年度からは、実際のサンプルに次世代シーケンサーを適用して生理的活性のある細菌の細菌叢解析を行う。実験に使用するイルミナ社のMiseqの場合、細菌の16S rRNA遺伝子のV3-V4領域を解析するが、昨年度の研究結果でnested PCRとPCR法による解析にほとんど違いが見られないことがわかったため、PCR, PMA-PCR，RT-PCRの３手法で細菌叢解析を行うつもりである。同時に３つの手法でサンプル中の全菌数測定も行い、細菌叢解析結果からすべての細菌、特に病原菌の菌数を推定する。実際のサンプルへの適用は、先ず細菌濃度の高い排水サンプルから実施する予定である。
また細菌濃度の低いサンプルについては、ろ過操作によって細菌が死滅するわけではないことがわかったので、PMA-PCR法の適用を考慮しろ過濃縮した細菌がPMA試薬で染色されないような処理方法を検討する。PMA処理方法が確立でき次第、河川水や海水などの環境水に次世代シーケンサーを適用して細菌叢解析を行う。
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| Causes of Carryover |
平成30年度に実際の排水・水環境サンプルを使用して実験するため、化学薬品代を確保しておいた。
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Research Products
(1 results)
