2018 Fiscal Year Research-status Report
ゲノム分子生物学による生存可能な病原性細菌の直接計数法の研究開発
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16K06559
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| Research Institution | Hachinohe National College of Technology |
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Principal Investigator |
矢口 淳一 八戸工業高等専門学校, その他部局等, 教授 (80342450)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
山本 歩 八戸工業高等専門学校, その他部局等, 准教授 (60523800)
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| Project Period (FY) |
2016-04-01 – 2020-03-31
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| Keywords | 次世代シーケンサー / PMA / PCR / ろ過濃縮 / 細菌叢 / RNA |
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| Outline of Annual Research Achievements |
平成30年度には先ずろ過濃縮したサンプルのPMA処理方法を検討した。以前の研究ではBacLight試薬による染色の結果、フィルターろ過により大腸菌の細胞膜が何らかの損傷を受けている可能性が指摘されていたが、PBS等を適切に使用することでろ過濃縮してもPMA試薬で染色されないように工夫することができた。そこで生活排水、その処理水、河川水の３つの水サンプルと消化汚泥にPCR, PMA-PCR，RT-PCRの３手法を適用して次世代シーケンサーを用いてそれぞれのサンプルの細菌叢解析を行った。生活排水と河川水ではPCRとPMA-PCRを適用したサンプルの細菌叢が類似していたが、RT-PCRを用いた場合細菌叢は異なる傾向を示した。処理水と消化汚泥では３つの手法で明らかな違いが認められた。さらにβ多様性を解析したところ、４つのサンプルとも手法によってβ多様性が大きく異なり、分析手法によって活性のある細菌叢に顕著な違いがあることが知られた。それぞれのサンプル内の多様性を示すα多様性は、排水を除いた３つのサンプルでPCRを用いた場合最も高く、排水ではRT-PCRが最も高くなった。
また新しく開発されたPMAxx試薬と従来のPMA試薬を比較する実験も行った。PMAxx試薬はPMAより生存細菌と死滅細菌の分別に効果的であること、活性汚泥のような多数の細菌群からなるサンプルに対しても有効であることが確認できた。PMAxxの添加濃度は、大腸菌と活性汚泥とで50μMが望ましいことが分かった。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
3: Progress in research has been slightly delayed.
Reason
今年度の研究成果で示したように、ろ過濃縮したサンプルのPMA処理方法の検討や新たに開発されたPMAxx試薬の効果の検討など当初予定していなかった研究課題に取り組む必要があったので、研究は少し遅れ気味になっている。また次世代シーケンサーによる細菌叢解析にかなりの委託分析費がかかり、予算の面からも制約がある。平成31年度には、排水処理プロセスに絞って細菌群挙動解析を実施する予定である。
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| Strategy for Future Research Activity |
平成30年度にろ過濃縮したサンプルのPMA処理方法が確立できたので、４つの環境サンプルにPCR, PMA-PCR，RT-PCRの３手法を適用して得られた細菌叢に大きな違いがあることが分かった。また新しいPMAxx試薬とPMA試薬を比較した結果、PMAxx試薬の方が分別効果が優れていたので、平成31年度の研究ではPMAxx試薬を使用して排水処理プロセスの各工程を解析する。プロセスの各段階で検水中の細菌叢解析を実施し、各工程が個別の細菌群、特に病原菌についてどのような効果があるか実証する。生活排水の消毒効果については多数の大腸菌が消毒後もVBNC状態で残存しているという報告もあり、それぞれの病原菌に及ぼす消毒効果を精査する。病原性細菌感染リスクの再評価については、処理プロセス中の挙動調査が終わり次第取り組み、微生物基準の検証や消毒方法の改善策の提案につなげたい。
また今年度までに得られた成果についてまとめ、論文として海外雑誌に投稿する予定である。また11月に広島で開催される8th IWA Microbial Ecology and Water Engineering Specialist Conference(MEWE2019)でも研究発表する予定である。
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| Causes of Carryover |
平成30年度は研究の進捗状況がやや遅れているため、使用できなかった分は、平成31年度に処理プロセス過程の解析を行う際のPMAxx試薬などの薬品代として使用する。
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