2017 Fiscal Year Research-status Report
Development of a platform for bio-production of useful compounds using S-adenosylmethionine-dependent enzymes
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16K06864
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| Research Institution | Hokkaido University |
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Principal Investigator |
佐藤 康治 北海道大学, 大学院工学研究院, 助教 (30360928)
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2016-04-01 – 2019-03-31
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| Keywords | S-アデノシルメチオニン / メチル基転移酵素 / 補酵素 / 葉酸 / 代謝工学 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
近年、合成生物学的手法を代謝工学へ応用することで、微生物により生産可能な化合物種が飛躍的に拡大されている。更なる拡張には、補酵素依存酵素の利活用は極めて重要であり、これを実現するには補酵素の供給系や再生系をもつプラットホーム開発が必須である。そこで本研究では、多様な化合物の合成に関与する補酵素Ｓ-アデノシルメチオニン (ＳＡＭ) 依存酵素を活用するためのプラットホーム構築を目的とする。
本年度は、ＳＡＭ依存メチル基転移酵素が副生成物であるＳ-アデノシルホモシステイン（ＳＡＨ）によって阻害されることを考慮し、ＳＡＨ分解系についてＳＡＭ合成系強化に先立ち検討した。ＳＡＨ分解経路としては大腸菌がもつ５’-ｍｅｔｈｙｌｔｈｉｏａｄｅｎｏｓｉｎｅ／ＳＡＨ ｎｕｃｌｅｏｓｉｄａｓｅ（Ｍｔｎ）とＳ-ｒｉｂｏｓｙｌｈｏｍｏｃｙｓｔｅｉｎａｓｅ（ＬｕｘＳ）の利用を検討した。この評価は、大腸菌粗酵素液を用いたｉｎ ｖｉｔｒｏ反応を行い、生成物をＨＰＬＣ解析し行った。その結果、プラスミドでＭｔｎおよびＬｕｘＳ遺伝子を高発現させた場合に、ＳＡＨ分解およびホモシステイン生成を確認した。
ＳＡＭ依存メチル基転移酵素に関しては、ラットおよびＭｙｘｏｃｏｃｃｕｓ ｘａｎｔｈｕｓ由来カテコール-Ｏ-メチル基転移酵素（ＣＯＭＴ、ＳａｆＣ）とヒト由来フェニルエタノールアミン-Ｎ-メチル基転移酵素（ＰＮＭＴ）について検討した。ｉｎ ｖｉｔｒｏ解析より、ＣＯＭＴとＳａｆＣの活性は確認した。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
3: Progress in research has been slightly delayed.
Reason
ＳＡＭ依存メチル基転移酵素には、ラットおよびＭｙｘｏｃｏｃｃｕｓ ｘａｎｔｈｕｓ由来カテコール-Ｏ-メチル基転移酵素 （ＣＯＭＴ、ＳａｆＣ）とヒト由来フェニルエタノールアミン-Ｎ-メチル基転移酵素（ＰＮＭＴ）を用いた。これらの活性は、各遺伝子を導入した大腸菌粗酵素液を用いたｉｎ ｖｉｔｒｏ反応を行い、生成物をＨＰＬＣ解析し評価した。ＣＯＭＴおよびＳａｆＣは、プロトカテク酸およびドーパミンを基質とし評価した結果、予想される生成物が検出された。よって、何れも活性型として発現していることがわかった。一方、ＰＮＭＴはノルアドレナリンを基質に反応を行ったが、予想される生成物は検出されなかった。ネガティブコントロールでもＳＡＭ分解が確認されたことから、ＳＡＭ分解活性の方がＰＮＭＴ活性よりも高くＳＡＭが消費されたため反応生成物が検出されなかったと推察した。
ＳＡＭ依存メチル基転移酵素は副生成物であるＳＡＨによって阻害されることを考慮し、ＳＡＨ分解系についてＳＡＭ合成系強化に先立ち検討した。大腸菌はＭｔｎとＬｕｘＳによる分解経路をもつため、その利用を検討した。はじめにＳＡＨを基質に大腸菌粗酵素液を用いたｉｎ ｖｉｔｒｏ反応を行い、生成物をＨＰＬＣ解析し評価した。しかしＳＡＨ分解は認められなかったため、Ｍｔｎの高発現を検討した。Ｍｔｎ遺伝子をプラスミドで高発現させたところ、数分でＳＡＨが消失されたことから、非常に高い活性を有することが確認された。この際、ホモシステインは検出されなかったため、次の反応を触媒するＬｕｘＳの高発現について検討した。Ｍｔｎ-ＬｕｘＳオペロンとして発現させたところ、ホモシステイン生成は検出されたが、ＭｔｎによるＳＡＨ消費速度よりも遥かに遅かった。
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| Strategy for Future Research Activity |
ＳＡＨ分解系として検討したＭｔｎ-ＬｕｘＳではホモシステイン生成が確認された。よってＳＡＭ依存メチル基転移酵素と共に大腸菌で発現させ、本研究の目指すプラットホームに適しているか、最終産物の生産能を指標に評価する。もしホモシステイン生成速度が課題と判断された場合には、遺伝子発現の順序を変更したＬｕｘＳ-Ｍｔｎオペロンや独立した発現系の構築等を試み、その影響を検討する。
上述以外のＳＡＨ分解系として、ＳＡＨ ｈｙｄｒｏｌａｓｅ（ＳＡＨａｓｅ）が知られており、反応生成物としてホモシステインとアデノシンを生成する。この副生成物であるアデノシンをＳＡＭの原料であるＡＴＰへと変換できれば、本研究の目指すプラットホームの高効率化が期待できる。しかし大腸菌はアデノシンをＡＭＰへとリン酸化する経路をもたないため、異種生物由来ａｄｅｎｏｓｉｎｅ ｋｉｎａｓｅを共発現させ、その効果を検証する。
ＳＡＭの基質であるメチオニン合成強化はレギュレーター遺伝子ｍｅｔＪの破壊により強化可能と報告があり、その破壊株を宿主として検討する。さらにグリシン開裂システム （ＧｃｖＴＰＨＬ） やセリンヒドロキシメチル転移酵素 （ＧｌｙＡ） によるメチオニン供給強化も検討する。
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