2018 Fiscal Year Annual Research Report
Complex protein fishing method using proximity dependent reaction of modified transglutaminase
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16K06865
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| Research Institution | Akita University |
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Principal Investigator |
後藤 猛 秋田大学, 理工学研究科, 教授 (10215494)
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| Project Period (FY) |
2016-04-01 – 2019-03-31
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| Keywords | トランスグルタミナーゼ / プロテオミクス / タンパク質探索 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
組織や細胞に発現しているタンパク質の動態を把握し，それらが織りなす相互作用の実態を解明するためには，既知のタンパク質と相互作用する未知のタンパク質を同定する必要がある。本申請研究は，基質特異性が低く反応性に富むStreptomyces mobaraensis由来トランスグルタミナーゼ（TGase）と既知タンパク質（Bait：餌）の融合体を調製し，得られたBait連結TGaseのBaitに相互作用する未知タンパク質（Prey）をTGaseの近接依存反応により蛍光標識して同定する新規なフィッシング法を開発することを目的とするものである。昨年度までの研究において，TGase高反応性ペプチドを付加した様々なTGaseを調製したが，自身の自己架橋反応による酵素的なBait-TGase融合体の調製は困難であった。
そこで，Bait融合TGaseを遺伝子的に調製する方が現実的と判断し，大腸菌による活性型Bait融合TGaseの生産法を検討した。正しく折りたたまれた活性型のTGaseとするためにはpro配列を有するTGase前駆体として発現させる必要があるが，TGase前駆体とBaitの融合体の場合には，Dispaseによる活性化処理によってBaitも加水分解される恐れがある。そこで，ペリプラズム内にpro配列と共に分泌発現させることによる，活性型Bait融合TGaseの直接生産を試みた。その結果，Baitのモデルタンパク質として用いたFRBをC末端に付加したTGase（TGase-FRB）はN末端付加体（FRB-TGase）と比較してペリプラズム発現量が多く，さらに精製したTGase-FRBはFRB-TGaseに比べて十分に高いTGase活性を有することが分かった。
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