2017 Fiscal Year Research-status Report
ヒト大脳皮質様オルガノイドを用いた脳疾患の病態解明
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16K06996
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| Research Institution | Kumamoto University |
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Principal Investigator |
沼川 忠広 熊本大学, 発生医学研究所, 特定事業研究員 (40425690)
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| Project Period (FY) |
2016-04-01 – 2019-03-31
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| Keywords | iPS細胞 / 大脳皮質 / 脳疾患 / 神経細胞 / オルガノイド |
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| Outline of Annual Research Achievements |
本研究では、1) 副腎白質ジストロフィー、2) プロピオン酸血症、および3) メープルシロップ尿症（MSUD）などの疾患細胞より樹立したiPS細胞を用いて、機能的ニューロンを2次元、および大脳皮質様オルガノイド(3次元)の形態で分化誘導する。そして、これらを用いて、それぞれの疾患における病態を、分子、細胞、および機能レベルで解析する。特に前年度では、MSUDにて神経細胞死（分岐鎖アミノ酸のロイシン、イソロイシン、バリンの曝露時）を確認した。そこで本年度では、2次元培養系として、プレシナプス形成が十分に行われる（プレシナプスマーカーであるsynapsin1の陽性シグナルが確認される）神経分化誘導後77日目のニューロンを用いた機能解析を行った。解析には、シナプス前部より放出される神経伝達物質の開口放出のモニターに有用である色素FM1-43を用いた。その結果、健常ニューロンでは、十分な神経伝達物質の放出機能が備わっていることが明らかになった。一方、MSUDのニューロンではその機能が著しく損なわれていた。これは、MSUDでは神経幹細胞からニューロンへの分化や成熟過程において、シナプス形成に係わるメカニズムに支障が生じている可能性を示している。また、MSUDのiPS細胞を用いた大脳皮質様オルガノイドの作成を行った。まず、健常大脳皮質様オルガノイドの維持日数に伴う、各発達マーカー遺伝子の発現解析行った。その結果、少なくとも35日まではオルガノイドのサイズは成長しており、培養日数を経るごとにDCX(幼若ニューロンマーカー)、TBR1（大脳皮質5-6層のニューロンマーカー）、MAP2（成熟ニューロンマーカー）などの発現増加を観察した。現在、シナプス関連分子なども含め、疾患オルガノイドとの比較解析を実施するためのサンプル回収を行っている。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
大脳皮質様オルガノイドの各成熟段階の遺伝子マーカー発現を解析したところ、長期培養したものであるほど、各オルガノイド間でのばらつきが観察されるケースが多かった。これは、脳様オルガノイド組織内では、複数の層構造様の領域が見られるため、それらの成長のばらつきが遺伝子マーカーのばらつきとして反映されている可能性を示している。そのため、成長を同調させるための培養条件をさらに検討するとともに、現在、そのリファレンスとして2次元培養系における成熟過程を精査している。そして現段階で、大脳皮質特異的なTBR1やCTIP2の発現上昇の結果も得られるようになった。しかし重要なことに、サンプルを回収できた少なくとも2カ月の培養維持期間では、MAP2やNeuroD1などの成熟ニューロンマーカーの発現は上昇を続けており、成熟過程全体を見通すためには、さらに長期間の培養維持が必要であることがわかってきた。一方で本年度では、77日目のニューロンを用いて、ターゲット疾患のひとつであるMSUDにおいて、プレシナプス機能の低下を見出すことができた。しかし、コントロール細胞を用いた100日以上の培養維持において初めて、ポストシナプス機能の指標となる神経伝達物質刺激に励起される細胞内カルシウム上昇が測定可能となることもわかってきた。また、シナプス結合を反映するニューロンネットワーク活動であるカルシウムの自発的オシレーションは、150日以上の維持が必要であることも明らかになってきた。現在、脳様オルガノイドの成長過程の精査のため、ネットワーク活動をモニターできるレベルの長期的2次元培養系のシステマティックな解析と並行し、安定した疾患脳様オルガノイドの作成に取り組んでいる。
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| Strategy for Future Research Activity |
大脳皮質様オルガノイドの長期維持に伴う各発達段階の遺伝子マーカー発現のばらつきの是正のために、培養条件の更なる検討を行う。そのため、MSUDをはじめとするターゲット疾患における長期2次元培養系においてのマーカー発現の詳細なプロファイル作成し、同時に機能解析を進める予定である。特に、ポストシナプス機能である神経伝達物質を含む興奮刺激でのカルシウム応答を測定する。また、シナプス結合と、それを反映する自発的カルシウムオシレーションによるニューロンネットワーク成立を健常ニューロンと疾患ニューロンとで比較する。
先述のように、既に安定している2次元培養系においての発達に伴うマーカー発現の推移を、健常ニューロンと疾患ニューロンとで比較検討し、得られつつある神経伝達物質放出機構の脆弱性の原因として考えられるメカニズムを追求する。これら得られた知見をヒントに、大脳皮質様オルガノイドにおける発達マーカーの発現推移や層構造特異的な局在の観察とともに、機能解析としてカルシウムイメージング等の実施を目指し、疾患特異的な神経機能の破綻の原因を、2次元培養系のみならず、3D培養系においても確認する。また、短期間での未成熟な培養系ではあるが、プロピオン酸血症iPS細胞由来の疾患ニューロンにおいても、神経伝達機能の低下を示唆する結果が得られつつある。この病気に関しても、より発達・成熟した段階において、疾患特異的な脆弱性形成の基礎メカニズムを明らかにしたい。
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| Causes of Carryover |
作出した大脳皮質様オルガノイドにおけるニューロンや、他の細胞集団であるグリア細胞等の分化・成熟課程において、100日を超えての安定した維持条件の検討や、相応する長期の2次元培養システムにおける各種マーカー遺伝子や分子の発現プロファイルの作成の必要性が改めて明らかになった。ここで、培養条件のシステマティックな検討を遂行するためには、時間的な制約（変更した条件の有効性を確かめるためには、培養の維持時間が律速になること）がネックとなっている。そのため、研究費を有効に使用するために今後への繰り越しを行った。今後、神経機能、および生化学的解析等が可能となる培養サンプルが順次利用できるようになるため、薬理学的アプローチのための試薬や、マーカー発現の確認のための抗体など、必要となる消耗品などに研究費を使用していく予定である。
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