Cell type analysis of clonally related cortical neurons using initial axonal projection pattern

2016 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 16K07011
• Research Institution: National Institute for Physiological Sciences
• Principal Investigator: 畠中 由美子 生理学研究所, 基盤神経科学研究領域, 特別協力研究員 (40271548)
• Project Period (FY): 2016-10-21 – 2020-03-31
• Keywords: 大脳皮質形成 / 発生・形態形成 / 細胞系譜 / 神経細胞分化 / ニューロンサブタイプ

Outline of Annual Research Achievements

多様性に富む大脳皮質ニューロンの産生過程を調べるために神経幹細胞、並びに中間神経前駆細胞の標識法を確立した。相同染色体間の組換えを利用して神経幹細胞由来の娘細胞を標識するため、既報に従いNestin-CreERT2ドライバーマウスとMADMレポーターマウスを交配し、Nestin-CreERT2(+/-) : MADM-11GT(+/+)マウスを準備した。これをさらにMADM-11TG(+/+)と交配し、妊娠12日目にタモキシフェンを投与することで、不等分裂開始直後の皮質神経幹細胞を標識できることを確認した。１つの幹細胞に由来する細胞群を追跡するため、幹細胞を散発的に標識する投与条件を確立した。投与数日後に脳を回収し、染色細胞の形態から初期投射パターンを、マーカー発現から細胞タイプを観察するための４重染色法も確立した。これまでに、各系譜の娘細胞は、その数や、初期投射パターンで分別される細胞タイプの組成について不均一であることが見られており詳細を解析している。さらに、中間神経前駆細胞由来の娘細胞を標識する目的で、Neurogenin2(Ngn2)-CreERT2ドライバーマウスを導入した。抗Cre抗体染色によりCreERT2の発現は内在的Ngn2の発現開始時期からやや遅れて発現を開始し、中間神経前駆細胞の分裂期まで見られることがわかった。そこで上記と同様にMADMレポーターマウスと交配し、妊娠期にタモキシフェンを投与すると、中間神経前駆細胞から生じる娘神経細胞を標識できることがわかった。予備的な解析の結果、１つの中間神経前駆細胞からは２つの神経細胞が生じること、これらは同じ初期投射パターンを持つこと、同じ分子マーカー発現をすることなどが明らかになりつつある。

Current Status of Research Progress

3: Progress in research has been slightly delayed.

Reason

維持しているマウスの肺パスツレラ感染事故の影響で、マウス実験ができない期間があった。さらに、事故対応のため感染マウスを処分したことで自然交配能を持つオスマウスの系統が途絶え、人工受精によりこれを復活させるために時間がかかりNgn2-CreERT2マウスを使用する実験が滞ったことによる。

Strategy for Future Research Activity

実験の実施にやや遅れはあったが、神経幹細胞／中間神経前駆細胞の標識法は確立したので、これらの細胞に由来する神経細胞の解析を継続して進める。標識細胞のライブ観察であるが、標識後脳スライスを作成し蛍光実体顕微鏡下でEGFPとtdTomatoの蛍光をそれぞれ検出できることを確認している。そこで、今後は当初の計画通り、各細胞系譜内で産生されるニューロンタイプの産生順を直接解析するためにタイムラプス解析を開始する。代表者が所属機関を移動したことにより使用する顕微鏡を２光子レーザー顕微鏡から、長時間ライブセル観察に適したニポウディスク方式の共焦点レーザースキャナー観察に変更することになったが、ライブイメージング実験に支障はない。

Causes of Carryover

採択決定の10月であったこと、並びに実験に使用するマウスの感染事故の影響が長引いたために、当初推進できない計画があり、物品費の支出が予定よりも少なくなったため。

Expenditure Plan for Carryover Budget

マウスを使用した実験を全面的に推進できる状況になったので、遅延計画を遂行するために前年度予定額を使用する。