2017 Fiscal Year Research-status Report
ゲノム編集技術を用いた新たなレット症候群の治療法開発に向けた基盤研究
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16K07047
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| Research Institution | Institute of Physical and Chemical Research |
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Principal Investigator |
岸 憲幸 国立研究開発法人理化学研究所, 脳科学総合研究センター, 研究員 (30594882)
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| Project Period (FY) |
2016-04-01 – 2019-03-31
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| Keywords | レット症候群 / MECP2 / ゲノム編集技術 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
レット症候群患者は正常なMECP2遺伝子を１コピー持っているという事実をもとに、近年進歩が著しいゲノム編集技術を用いて、不活性化している正常なMecp2遺伝子を再活性化させることを目標にしている。
平成２９年度は、前年度に引き続き、評価系として一方のMecp2遺伝子座に蛍光蛋白GFPをノックインし、もう一方のMecp2遺伝子を破壊したモニター用のマウスES細胞の樹立を目指した。
評価系のマウスES細胞作製については、理研バイオリソースセンターよりBRC6というメスのマウスES細胞株を入手し、我々の培養法でも問題なく継代および凍結ストックを作ることを確認できた。
まず１アリールのMecp2遺伝子の破壊のため、BRC6細胞にMecp2遺伝子を破壊するCRISPR/Cas9コンストラクトをトランスフェクションにて導入した。１回目のトランスフェクションでは、Mecp2遺伝子の標的遺伝子にdeletion変異を導入したES細胞を得られたが、９塩基の欠損であった。この変異によりMeCP2蛋白のうち３アミノ酸のみが欠損した蛋白ができることが予想され、MeCP2蛋白の機能はおおよそ維持されてしまうことが推測されたため、再度同じ実験を繰り返した。２回目のトランスフェクションでは１塩基の挿入変異が入ったクローンが確認された。そこで１塩基の挿入変異が入ったES細胞株を単離・増幅し、Mecp2遺伝子のストップコドン付近にdouble strand breakを生じさせるためのCRISPR/Cas9コンストラクトと、ノックインさせるためのGFP遺伝子を含むドナーベクターをトランスフェクションした。標的配列に挿入された場合に検出されるPCRで陽性クローンを獲得した。現在、目的としている方のアリールにノックインされているか、標的配列以外にドナーベクターが挿入されていないか確認を行っている。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
平成２９年度は、平成２８年度に引き続きMecp2-GFP/-のモニター用のES細胞樹立を行った。モニター用ES細胞については概ね樹立を完成し、現在、最終的な確認を行っている。モニター用のES細胞樹立に多くの時間を費やした理由として、CRISPR/Cas9によるDouble Strand Breakを引き起こす確率は非常に高いガイドRNAをスクリーニングで得られたが、変異が３塩基や９塩基の欠失など３の倍数のため変異が生じてもin frameになってしまい、MeCP2の機能がほぼ温存されてしまうことになるため２回スクリーニングを行い直した。その中で１塩基挿入されたES細胞が含まれていること見いだし、複数回の絞り込みで１塩基挿入されたES細胞を単離・増殖したため、予定より長い時間がかかった。このクローンを元にもう１つのアリールにGFPをノックインする実験を行った。理論上、ドナーベクターがノックインされる確立より、変異が挿入される確率が高い上、１塩基挿入されていない方のアリールにGFPのコンストラクトがノックインされる必要があり、このスクリーニングにも多くの時間を要した。
最終的にMecp2-GFP/-のES細胞株樹立まであと一歩までに達した。平成３０年度の早い段階でモニター細胞を樹立し、神経誘導に向かいたいと考えている。
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| Strategy for Future Research Activity |
平成２９年度は、達成を目標としていたモニター用のES細胞株の樹立の完成には至らなかったが、一歩手前のステップまで終えることができた。モニター用のES細胞株の樹立は平成３０年度に持ち越しになったが、早期に完了し、神経誘導、Mecp2遺伝子のプロモーター領域に結合する人工転写因子dCas-VP64の導入による、野生型Mecp2遺伝子の再活性実験を行う予定である。
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| Causes of Carryover |
当初の計画では平成２９年度にはモニター用細胞のES細胞を樹立し、神経誘導するための試薬を購入する予定であったが、計画が若干遅れたため、これらの試薬の購入が行われなかった。平成３０年度にはモニター用細胞のES細胞を樹立し、神経系への誘導や、Mecp2プロモーターを活性化するための人工蛋白をコードするウイルスを購入する予定なので、平成２９年度に使用されなかった助成金と平成３０年度分の助成金を全額使用する予定である。
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