2016 Fiscal Year Research-status Report
二種類の同一サブクラスGタンパク質共役型受容体によるシグナル伝達のクロストーク
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16K07063
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| Research Institution | Saitama Medical University |
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Principal Investigator |
周防 諭 埼玉医科大学, 医学部, 講師 (20596845)
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| Project Period (FY) |
2016-04-01 – 2019-03-31
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| Keywords | 神経伝達物質 / 受容体 / 線虫 / C. elegans / ドーパミン / オクトパミン |
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| Outline of Annual Research Achievements |
Gタンパク質共役型受容体は様々な伝達物質の受容体であるが、一つの伝達物質に対し類似した受容体が複数存在することが知られている。線虫C. elegansでは、餌を感知するとドーパミンによるシグナル伝達が働くが、これまでに、その作用でオクトパミンのシグナル伝達が抑制されること、そしてオクトパミンはSIAと呼ばれる神経細胞の二種類のオクトパミン受容体に作用していることを明らかにしている。本研究では、この線虫の系を用いて、類似した受容体が複数存在することの生理的な意義を明らかにすることを目標にしている。カルシウムイオン濃度を測定できる蛍光たんぱく質プローブの遺伝子とSIA神経特異的な遺伝子発現を起こすプロモーターの融合遺伝子を作成し、線虫に導入して、遺伝子導入株を作成した。細胞内でシグナル伝達が起きるときにカルシウムイオンの濃度が変化することが知られているので、この株を用いることでSIAニューロンでのシグナル伝達を解析することができる。このプローブ導入株でプローブタンパク質が確かにSIA神経で発現することを確認した後、SIA神経細胞での蛍光イメージング解析を行った。これらの神経細胞で自発的な蛍光変化が観察されたので、カルシウムイメージング解析自体は機能していると考えられる。しかし、餌のあるなし、あるいはオクトパミン投与前後での蛍光の顕著な変化は観察されていない。cAMPに対するプローブ遺伝子を用いた株、ドーパミン神経にこれらプローブを発現させる株を作成し、さらなる解析を行っている。
このドーパミン－オクトパミン－SIAの経路が、線虫の行動にどのような影響を及ぼすのかはわかっていなかった。本研究を行う過程で、ドーパミン－オクトパミン経路によって線虫の運動が制御されているということを見出した。この結果は、この経路が生理的に有意義な役割を担っていることを示唆している。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
28年度の計画では、カルシウムとcAMPの蛍光プローブ発現用のプラスミドを作成し、マイクロインジェクションにより線虫に導入して、プローブを持った線虫を作成することと、この株を用いてオクトパミンを投与した時の蛍光変化を測定することを予定していた。プラスミドの作成とその導入は終了し、SIA神経細胞でのプローブの発現も確認された。プローブ導入株を用いたイメージング解析については、当初計画していた線虫を接着剤で固定してオクトパミンを投与する方法に加えて、Olfactory chipと呼ばれるマイクロ流路デバイスを用いて線虫を半固定し、その先端部分（口と感覚器がある）に餌を流したり止めたりするという方法で行った。これまでに、SIA神経細胞でオクトパミンあるいは餌に依存しない自発的な蛍光強度の変化は見られたため、カルシウムイメージングは機能していると考えられる。しかし、オクトパミンや餌に対する反応はこれまでのところ見られていない。
研究を行う過程で、ドーパミンやオクトパミンの合成酵素の変異体では運動が変化することが見出され、ドーパミン－オクトパミンの経路が運動の制御に関与していることが示唆された。ドーパミン－オクトパミン経路はSIAからのアセチルコリンの放出を制御していることを示しているが、線虫の行動などの表現型に有意な影響があるか分かっていなかった。この経路に生理的な意義があると分かることは、本研究課題から得られる知見が生理的な有意義な現象についてであることを確実にして、その重要性を高める。従って、行動制御に関しての結果は本研究にとって重要であるし、さらなる解析に値すると考えられる。
蛍光プローブを用いた解析では、少し遅れているが、線虫の行動について予想外の発見があったので、総合的にみて順調であると判断した。
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| Strategy for Future Research Activity |
SIA神経細胞でのイメージング解析について、餌あるいはオクトパミンに対するプローブの蛍光強度の変化が見られていないので、条件検討を行って、反応が見られる条件を探していく。餌あるなしについては、上流のドーパミン神経細胞での測定を行いながら、流路に流す餌の最適な条件を検討する。ドーパミン神経細胞は機械的に餌である大腸菌に触れることで認識しているとされているので、より高濃度の大腸菌を暴露していく。オクトパミンの投与実験では、線虫が存在する溶液中にオクトパミンを加えているが、線虫が溶液中に存在する場合には、線虫体内へのオクトパミンの取り込み速度が十分でなく、数十分の観察時間では反応が見えない可能性がある。最適な緩衝液の検討を行うとともに、体内への取り込みを促進するために、摂食行動を促進する条件での検討を行い、SIA神経細胞での蛍光プローブの反応がみられる条件を探していく。
これまでの研究で、オクトパミンを培地に加えるとSIA神経細胞でのCREBの活性化が起こること、オクトパミンは直接SIAに作用すること、そしてこの反応には2種のオクトパミン受容体が必要であることを示している。イメージング解析でSIAにおいてカルシウムイオンやcAMPの濃度反応が見られなかったとしても、SIA神経細胞で2種の受容体が何らかの機構で協調して働いているのは確かであり、研究計画にあった受容体の二量体化の解析や受容体の局在の解析は行う意義があることは変わらない。上記の条件検討で反応の見られる条件が見つからなかった場合でも、二量体化解析や局在解析に必要なプラスミドや線虫株の作成を進めていく。
ドーパミン－オクトパミン経路の生理的な役割を明らかにすることは、上述の通り本研究にとって重要であると考えられる。従って、ドーパミンとオクトパミンにより運動の制御のメカニズムについても解析をさらに進めていく。
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| Causes of Carryover |
応募時研究計画ではイメージング用の高性能CCDカメラ、28年度交付申請段階では還流装置を購入し、既に研究室に設置してある蛍光顕微鏡に取り付けて使用することを検討していた。しかし、交付決定した予算は申請の予算よりも小さいので、これらの設備について十分な性能を持つものを購入すると他の予算を十分に確保することが難しかった。また、連携研究者の坪井貴司博士の研究室では、イメージング解析用の顕微鏡システムが設置されており、本年度にはマイクロ流路デバイスも使用可能になった。これを用いることで、本研究で当初予定していた接着剤で線虫を固定する方法に加えて、餌を流す実験が可能になる。この顕微鏡システムの使用時間に、本研究の実験を行う分の余裕があったので、イメージング実験は坪井研究室の設備を使用することにした。このため、上記のCCDカメラや還流装置の購入はしなかったので、次年度使用額が生じた。
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| Expenditure Plan for Carryover Budget |
29年度（および30年度）には、SIAでのイメージング解析に加えて、2種類のオクトパミン受容体についての二量体化や線虫個体内での細胞内局在の解析も開始する予定である。その結果、分子生物学実験試薬、線虫飼育用試薬、プラスティック器具、細胞培養試薬、抗体などの消耗品を含めた物品費の合計が28年度よりも多く必要になることが応募時の研究計画の段階から予定されている。しかし、29年度、30年度の予算は28年度より少ない。従って、28年度の未使用額については、より多く必要となる物品費に充てることを計画している。さらに、ドーパミン－オクトパミン経路の生理的意義について重要な知見が得られており、そのさらなる解析のための物品費についても一部使用することを計画している。
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Research Products
(4 results)
