2016 Fiscal Year Research-status Report
アストロサイトでの重炭酸イオンを介したpH調節の生理的意義について
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16K07068
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| Research Institution | Showa Pharmaceutical University |
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Principal Investigator |
水谷 顕洋 昭和薬科大学, 薬学部, 教授 (30242861)
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| Project Period (FY) |
2016-04-01 – 2019-03-31
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| Keywords | NBCe1 / IRBIT / tripartite synapse |
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| Outline of Annual Research Achievements |
本研究は、中枢神経系シナプス周囲を囲んでいるアストロサイト突起部分に発現・局在している脳型splicing variantであるNa+/HCO3-共輸送体、bNBCe1とその結合調節分子IRBIT に着目し、このbNBCe1/IRBIT複合体によるシナプス間隙とアストロサイト内のpH調節機構が、シナプス伝達と脳機能にどんな役割を果たしているかを明らかにする研究である。本年度は、
１．生後３週で全身アシドーシスにより死に至るNBCe1ノックアウトマウスをレスキューするための、腎近位尿細管に特異的に腎臓型splicing variantであるkNBCe1を発現させたトランスジェニックマウスの作製
２．bNBCe1に特異的に結合する分子の探索
を進めた。
１．に関しては、NBCe1をコードするSLC4A4遺伝子の上流領域のクローニングと同領域を含むBACの調製を行った。また、ヒトbNBCe1に検出を容易にするために、HA-tagをC-末端に付したcDNAの作製し、ウシ成長ホルモンpolyadenylation signalを用いて、トランスジーンを作製した。
２．に関しては、bNBCe1特異的なC末端領域をGST融合タンパク質として大腸菌に発現・精製し、この融合タンパク質と結合する分子をマウス脳粗抽出液中から得た。この中には、カルシニューリンとPDZドメインを有する足場タンパク質であるDLG1等が含まれていた。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
3: Progress in research has been slightly delayed.
Reason
上記、トランスジェニックマウスを作成するためのトランジーン作成の際、プロモーター領域のクローニングに予想外の時間を費やしてしまったことと、構築したトランスジーンが機能するかを確認するべく、in vitroで近位尿細管に発現させる系の確立することを試み、これにも時間を費やしてしまった。
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| Strategy for Future Research Activity |
結局、in vitro近位尿細管細胞発現系は確立できず、構築したトランスジーンが機能するかどうかは、実際トランスジェニックマウスを作成して確認することにする。次年度は、このトランスジーンを用いたトランスジェニックマウス作成完成を目標とする。
また、bNBCe1特異的に結合する候補分子が幾つか同定されており、これらについてその結合をin vivoで確認し、その相互作用の生理的意義を明らかにしていく。
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| Causes of Carryover |
本年度、トランスジェニックマウス作成費用として、1,000,000円を予算計上していたが、トランスジーンの作成に手間取り、トランスジェニックマウス作成を開始することができず、その予算が余ったことが理由である。
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| Expenditure Plan for Carryover Budget |
現在、トランスジーンの作成は終了しており、本年度予定していたトランスジェニックマウス作成に本額使用する。
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