2017 Fiscal Year Research-status Report
非天然アミノ酸を使用したin vivoでのシナプトタグミンの立体構造変化の検出
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16K07072
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| Research Institution | Osaka Medical College |
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Principal Investigator |
坂田 宗平 大阪医科大学, 医学部, 講師 (40528006)
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| Project Period (FY) |
2016-04-01 – 2019-03-31
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| Keywords | 非天然アミノ酸 / 遺伝コード拡張 / ゼブラフィッシュ / シナプス前終末 / シナプトタグミン |
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| Outline of Annual Research Achievements |
本研究課題ではシナプス前週末において、神経伝達物質の放出に中心的な役割を果たしているシナプトタグミンと呼ばれるタンパク質が、実際に神経伝達物質を放出する際にどのような構造変化を伴い機能を発揮するのか、生体内に存在する状態のまま構造変化を蛍光を利用して捉えることを最終的な目標として推進している。実験動物としてゼブラフィッシュを用いている。ゼブラフィッシュはモデル動物として広く利用されており、特に幼魚は透明なため、生きた状態で体内の蛍光シグナルを検出することができ、かつ遺伝子導入や遺伝子改変などの方法論も確立されつつあり本研究に適した実験動物である。ゼブラフィッシュの体内で特定のタンパク質を蛍光ラベルするために、本研究では蛍光を持つ人工アミノ酸（Anap）を組み込むことを計画した。人工アミノ酸の組み込みには人工アミノ酸のみを認識するtRNA、およびこのtRNAに人工アミノ酸を付加する酵素が必要であり、本実験の遂行にはこれらのものを恒常的にゼブラフィッシュの体内で発現するトランスジェニック動物の構築が必要となる。そのために本年度、tRNAと酵素をコードするプラスミドを構築した。このプラスミドにはゲノムへの挿入効率が非常に高くなると報告されているTol2 transposaseを用いた方法が使える配列も組み込んであり、これをゼブラフィッシュの受精卵に顕微注入することで、数か月後にトランスジェニック動物が完成するものと考えられる。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
本研究の遂行に重要であるトランスジェニック動物の作成の目途がつきつつある。よっておおむね順調に進展しているとした。
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| Strategy for Future Research Activity |
トランスジェニック動物の作成には数カ月時間がかかるが、作成後はまず人工アミノ酸の挿入に必要なtRNAおよび酵素がゼブラフィッシュの体の中で実際にどの程度機能し得るか検討する。その後にシナプトタグミンに人工アミノ酸を導入することを目指して研究を進めていく予定である。
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| Causes of Carryover |
前年度まではトランスジェニック動物作成のためのプラスミドの構築に専念したため、当初使用する予定であった蛍光計測を行うが必要なかった。蛍光測定を行う機器を購入しなかったため、次年度使用額が生じた。平成３０年度には蛍光測定を行う機器および人工アミノ酸等をゼブラフィッシュの受精卵に導入するのに必要な機器や試薬の購入を予定している。
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