超高効率ノックインシステムの開発

2016 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 16K07085
• Research Institution: Tokyo Medical and Dental University
• Principal Investigator: 相田 知海 東京医科歯科大学, 難治疾患研究所, 准教授 (50540481)
• Project Period (FY): 2016-04-01 – 2019-03-31
• Keywords: CRISPR / PITCh / MMEJ / ノックイン / Exo1

Outline of Annual Research Achievements

CRISPRを用いた長い遺伝子カセットのノックインは、特にマウス等の生物個体では依然困難である。ノックインには通常、相同組換え機構が用いられるが、その頻度は一般に極めて低い。平成28年度は、マウス受精卵でのDNA修復機構のおよそ半数を占めるマイクロホモロジー媒介末端結合（MMEJ）を応用したノックイン方法を開発した。この高頻度のMMEJに基づくノックインシステム・PITChは、受精卵内でCRISPRによりドナーDNAを切断して損傷修復反応を誘導すると共に、遺伝子カセット両末端にゲノムDNAに相同な40塩基マイクロホモロジーを付加して正確なノックインを促進する。現在困難とされる5000塩基の遺伝子のノックインをモデルとして、PITChによるノックインマウス作製を行ったところ、およそ10%の効率でノックインマウスを得ることに成功した。しかしながらその効率は、世界的な平均値に比べて相当高いものの、申請者の従来法に比べると1/3程度であった。そこで培養細胞系でのスクリーニング系を構築・探索し、多くのMMEJエンハンサーを同定、MMEJの分子機構の全貌を明らかした。これらのMMEJエンハンサーのうち、Exo1に着目してその後の実験を行なった。Exo1の過剰発現により、ヒト培養細胞でのノックイン効率は中程度に高まった。次にExo1を加えて、上記の5000塩基の遺伝子のノックインマウス作製を行ったところ、そのノックイン効率を、30%を越えるまでに高まることに成功した。さらにこの手法を用いて、現在最も困難とされるfloxマウスの作製を行ったところ、同様に30%を越えるノックイン効率でfloxマウスを得ることに成功した。以上から、Exo1で増強したMMEJに基づくPITCh法により、ヒト細胞及びマウス受精卵で高効率なノックインが実現された。本研究成果は論文発表した。

Current Status of Research Progress

1: Research has progressed more than it was originally planned.

Reason

研究は順調に進展している。特にMMEJエンハンサー分子群の同定と、これを用いたPITCh法の高効率化、そしてそのノックインマウス作製への応用が実現し、論文発表に至った。

Strategy for Future Research Activity

Exo1増強PITCh法は高効率ノックインを実現したが、その効率はマウスでは依然30%強であり、さらなる高効率化が必要である。MMEJの最適化、CRISPR活性化の最大化を進め、これらの組み合わせにより高効率化を実現していく。

Causes of Carryover

研究の進展により平成28年度の計画を効率的に完了したため、次年度使用額が生じた。

Expenditure Plan for Carryover Budget

平成29年度の研究計画促進のため、次年度使用額はそれら研究の物品費に用いる。

Research Products

• [Journal Article] Gene cassette knock-in in mammalian cells and zygotes by enhanced MMEJ (2016)
  • Author(s): Tomomi Aida, Shota Nakade, Tetsushi Sakuma, Yayoi Izu, Ayu Oishi, Keiji Mochida, Harumi Ishikubo, Takako Usami, Hidenori Aizawa, Takashi Yamamoto, Kohichi Tanaka
  • Journal Title: BMC Genomics Volume: 17 Pages: 979
  • DOI: 10.1186/s12864-016-3331-9
  • Peer Reviewed / Open Access / Acknowledgement Compliant