2016 Fiscal Year Research-status Report
Cpox変異マウス系統群を用いた加齢白内障発症機序の解明
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16K07086
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| Research Institution | Shinshu University |
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Principal Investigator |
森 政之 信州大学, 学術研究院医学系, 准教授 (60273190)
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| Project Period (FY) |
2016-04-01 – 2019-03-31
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| Keywords | 白内障 / 遺伝子 / コンジェニック系マウス / ポルフィリン症 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
Cpox遺伝子に活性低下型突然変異をもつマウス系統群を用いて、白内障の発症を遅延／早期化する修飾遺伝子の同定を進めた。
第3染色体上の白内障早期化遺伝子に関しては、（コンジェニックx BALB.NCT-Cpoxnct）F1 x BALB.NCT-Cpoxnct戻し交雑仔群を作出した。戻し交雑仔のうち、D3Mit208 (26.57 cM)とD3Mit315 (50.09 cM)の間で組み換えが生じている個体に関して、当該染色体領域におけるハプロタイプと白内障発症までの日数を調査した結果、早期化遺伝子の存在範囲はD3Mit39 (47.69 cM)よりもセントロメア側であることが示唆された。
第16染色体の白内障早期化遺伝子に関しては、BALB.NCT-Cpoxnctの遺伝的背景にNCT由来の第16染色体のD16Mit32 (2.33 cM)～D16Mit45 (30.66 cM)の領域を導入したダブルコンジェニック系マウス（BALB.NCT-Cpoxnct-Chr 16NCT）を、28年度末までに戻し交配8世代まで進めることができた。各世代マウスにおける白内障発症時期データから、この領域に白内障早期化遺伝子が存在することが示唆された。
NCT系マウスの全ゲノム解析を他機関の研究者との共同研究として行なった。その結果、当該染色体領域内での塩基変異、およびコピー数変異データを網羅的に取得することができた。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
白内障の発症を遅延／早期化する修飾遺伝子の染色体存在領域の限局化を目的としたコンジェニック系マウス、およびそれを親系統とした戻し交雑仔群の育種は、順調に世代を進めることができた。予測通りに当該染色体領域に修飾遺伝子が存在することを支持するデータが得られている。しかしながら、白内障発症時期は個体ごとのバラツキが予期していた以上に大きく、限局化にはさらなる個体数が必要である。
当初予期していなかった問題点として、NCT系マウスは子どもの成育が悪く、ほとんどが離乳前に死亡してしまうことが判明した。したがって、眼球レンズなどの解析材料の入手が制限された。離乳前での死亡の原因として、NCT系マウスに特異的な遺伝子変異を同定した。仔を里親保育につけることで離乳前での死亡をある程度回避できた。
申請時には計画していなかったこととして、他機関の研究者からマウス全ゲノム解析の共同研究の提案があり、その対象としてNCT系マウスを含めることができた。このために、次年度に予定している修飾遺伝子同定のための基盤となるデータを前倒しで取得することができた。
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| Strategy for Future Research Activity |
第3染色体、および第16染色体に関するサブコンジェニック系マウスの育種を継続し、白内障発症を遅延／早期化する修飾遺伝子の存在領域の限局化を進める。
平行して修飾遺伝子の同定を試みる。NCT系マウスの全ゲノム解析により得られたデータに基づき、当該染色体領域内に存在し、かつ変異を含む遺伝子をリストアップする。サンガー法により塩基変異を確認するとともに、PolyPhen-2、およびSHIFTプログラムを併用して解析し、変異の遺伝子産物機能への影響があるものをリストアップする。
変異の効果を実験的に検証する。それが酵素をコードする遺伝子の場合、レンズまたは他の臓器での酵素活性に違いがあるか否か、酵素による反応産物、および基質の量を調査する。遺伝子の上流域に多型（変異）が同定された場合は、プロモーターアッセイ、リアルタイムQuantitative PCR法、Western blot解析により、遺伝子転写量、およびタンパク質発現量に違いがあるか否かを調査する。
これらに変化が認められた場合は、第16染色体上の遅延遺伝子に関してはNCTの、また第3染色体、および第10染色体上の早期化遺伝子に関してはBALB.NCT-Cpoxnctを背景として、CRISPR/Cas9システムにより遺伝子改変マウスを作出する。もしも前者において白内障発症時期が遅延し、後者において早期化したならば、それらが白内障遅延遺伝子であることが確定できる。
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| Causes of Carryover |
他機関の研究者からマウス全ゲノム解析の共同研究の提案があり、その対象としてNCT系マウスを含めることができた。その費用はその共同研究機関が負担してくれたために、予定していた塩基配列データの取得のための実験が不要となり、前年度未使用額が生じた。
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| Expenditure Plan for Carryover Budget |
次年度使用額はH29年度請求額と合わせて、物品費に使用する計画である。
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