ゲノム編集において予期せぬリアレンジを抑制し確実に相同組換えを起こす手法の開発

2016 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 16K07093
• Research Institution: Kumamoto University
• Principal Investigator: 荒木 喜美 熊本大学, 生命資源研究・支援センター, 教授 (90211705)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 荒木 正健 熊本大学, 生命資源研究・支援センター, 准教授 (80271609)
• Project Period (FY): 2016-04-01 – 2019-03-31
• Keywords: ゲノム編集 / 相同組換え / 遺伝子改変マウス

Outline of Annual Research Achievements

CRISPR/Casを用いたゲノム編集は、DNAの２本鎖切断後に起こる修復反応を利用した非常に強力なゲノム改変ツールである。しかし、我々は、マウスES細胞や受精卵において、非相同末端結合修復(NHEJ)による微小変異や、相同組換え(HR)によるノックインを行った時に、目的通りの変異が入ったアレルの対立アレルでは、かなりの頻度でPCRでは検出できないほどの大きなリアレンジが生じていることを発見した。つまり、２本ある相同染色体のうち、目的とした変異の起こっていない方の染色体では、何が起こっているのか分からない状態である。これはゲノム編集の特徴でもあるホモ変異を直接単離出来るという利点に致命的な影響を与え、効率よい解析を困難にする。我々は、このリアレンジは、マイクロホモロジーを利用した組換え(MMEJ)が原因と考えており、本研究では、マウス受精卵やES細胞において、正確に変異を導入出来る相同組換えを、ホモ変異体を取得可能な高頻度で起こすシステムの確立を目的とする。
ES細胞におけるリアレンジの方が非常に顕著であるので、まず、ES細胞で検討するための相同組換え検出系を構築した。この系では、リアレンジ無く相同組換えが起こった時にはX-gal染色で染色されるが、リアレンジが起こると染色されない。現在までに複数のNHEJ阻害剤やMMEJ阻害剤を検討したが、まだ顕著に効率を上げる阻害剤の同定には至っていない。そこで、NHEJやMMEJを起こさない、Cas9 D10A nickaseを用いる系を検討した。nickaseの問題点は、野生型のCas9より効率が劣ることである。ES細胞における導入方法を検討することで、相同組換え効率を上昇させることに成功した。
また、マウス受精卵での検討を容易にすべく、エレクトロポレーションによる変異導入系を完成させた。

Current Status of Research Progress

3: Progress in research has been slightly delayed.

Reason

熊本地震により、一部の試薬やES細胞クローンを失ったこと、また、細胞培養環境の復帰に時間がかかったため、数ヶ月進捗に遅れが生じた。現在は、完全にもとに戻っており、遅れを取り戻すべく、研究を進めている。

Strategy for Future Research Activity

相同組換え時のリアレンジ検出系の再構築が出来たので、ES細胞でのリアレンジ抑制に効果を示すような小分子インヒビターのスクリーニングを続行する。
また、受精卵でのエレクトロポレーションの系も構築できたので、ES細胞で効果の見られたインヒビターがあれば、受精卵での効果も検討していく。

Causes of Carryover

熊本地震により、一部の細胞株や試薬が紛失したこと、細胞培養室の復旧に時間を要旨なこと等で実験の進捗に遅れが出たため。

Expenditure Plan for Carryover Budget

平成29年度と30年度に半分ずつを使用していく計画である。

Research Products

• [Journal Article] Severe ocular phenotypes in Rbp4-deficient mice in the C57BL/6 genetic background. (2016)
  • Author(s): Shen, J., Shi, D., Suzuki, T., Xia, Z., Zhang, H., Araki, K., Wakana, S., Takeda, N., Yamamura, K., Jin, S. and Li, Z.
  • Journal Title: Lab. Invest. Volume: 96 Pages: 680-691
  • DOI: 10.1038/labinvest.2016.39. Epub 2016 Mar 14.
  • Peer Reviewed / Int'l Joint Research
• [Journal Article] The importance of basonuclin 2 in adult mice and its relation to basonuclin 1. (2016)
  • Author(s): Vanhoutteghem, A., Delhomme, B., Herve, F., Nondier, I., Petit, J. M., Araki, M., Araki, K. and Djian, P.
  • Journal Title: Mech. Dev. Volume: 140 Pages: 53-73
  • DOI: 10.1016/j.mod.2016.02.002. Epub 2016 Mar 2.
  • Peer Reviewed / Int'l Joint Research
• [Journal Article] Rad18 confers hematopoietic progenitor cell DNA damage tolerance independently of the Fanconi Anemia pathway in vivo. (2016)
  • Author(s): Yang, Y., Poe, J. C., Yang, L., Fedoriw, A., Desai, S., Magnuson, T., Li, Z., Fedoriw, Y., Araki, K., Gao, Y., Tateishi, S., Sarantopoulos, S. and Vaziri, C.
  • Journal Title: Nucleic Acids Res. Volume: 44 Pages: 4174-8418
  • DOI: 10.1093/nar/gkw072. Epub 2016 Feb 15.
  • Peer Reviewed / Open Access / Int'l Joint Research
• [Journal Article] Cathepsin D in pancreatic acinar cells is implicated in cathepsin B and L degradation, but not in autophagic activity. (2016)
  • Author(s): Mehanna, S., Suzuki, C., Shibata, M., Sunabori, T., Imanaka, T., Araki, K., Yamamura, K., Uchiyama, Y. and Ohmuraya, M.
  • Journal Title: Biochem. Biophys. Res. Commun. Volume: 469 Pages: 405-411
  • DOI: 10.1016/j.bbrc.2015.12.002. Epub 2015 Dec 9.
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] Mutation of the key residue for extraribosomal function of ribosomal protein S19 cause increased grooming behaviors in mice. (2016)
  • Author(s): Chen, J., Kaitsuka, T., Fujino, R., Araki, K., Tomizawa, K. and Yamamoto, T.
  • Journal Title: Neuroscience Letters Volume: 629 Pages: 221-226
  • DOI: 10.1016/j.neulet.2016.07.022
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] Two transgenic mouse models for beta subunit components of succinate-CoA ligase yielding pleiotropic metabolic alterations. (2016)
  • Author(s): Kacso, G., Ravasz, D., Doczi, J., Nemeth, B., Madgar, O., Saada, A., Ilin, P., Miller, C., Ostergaard, E., Iordanov, I., Adams, D., Vargedo, Z., Araki, M., Araki, K., Nakahara, M., Ito, H., Gal, A., Molnar, M., Nagy, Z., Patocs, A., Adam-Vizi, V., and Chinopoulos C.
  • Journal Title: Biochemical J. Volume: 473 Pages: 3463-3485
  • Peer Reviewed / Int'l Joint Research
• [Journal Article] Interstitial pneumonia induced by bleomycin treatment is exacerbated in Angptl2-deficient mice. (2016)
  • Author(s): Motokawa, I., Endo, M., Terada, K., Horiguchi, H., Miyata, K., Kadomatsu, T., Morinaga, J., Sugizaki, T., Ito, T., Araki, K., Morioka, S. M., Manabe, I., Samukawa, T., Watanabe, M., Inoue H. and Oike, Y.
  • Journal Title: Sci. Rep. Volume: 4 Pages: 34690
  • DOI: 10.1038/srep34690.
  • Peer Reviewed / Open Access
• [Journal Article] Protein kinase D regulates positive selection of CD4+ thymocytes through phosphorylation of SHP-1. (2016)
  • Author(s): Ishikawa, E., Kosako, H., Yasuda, T., Ohmuraya, M., Araki, K., Kurosaki, T., Saito, T. and Yamasaki, S.
  • Journal Title: Nat. Commun. Volume: 7 Pages: 12756
  • DOI: ncomms12756 [pii]10.1038/ncomms12756
  • Peer Reviewed / Open Access
• [Journal Article] Mtu1-mediated thiouridine formation of mitochondrial tRNAs is required for mitochondrial translation and is involved in reversible infantile liver injury. (2016)
  • Author(s): Wu, Y., Wei, F.-Y., Kawarada, L., Suzuki, T., Araki, K., Komohara, Y., Fujimura, A., Kaitsuka, T., Takeya, M., Oike, Y., Suzuki, T. and Tomizawa, K.
  • Journal Title: PLOS Genet. Volume: 12 Pages: e1006355
  • DOI: 10.1371/journal.pgen.1006355
  • Peer Reviewed / Open Access
• [Journal Article] Novel method to rescue a lethal phenotype through integration of target gene onto the X-chromosome. (2016)
  • Author(s): Sakata, K., Araki, K., Nakano, H., Komazawa-Sakon, S., Lee, G. E., Hashimoto, D., Suzuki, C., Uchiyama, Y., Notohara, K., Gukovskaya, A. S., Gukovsky, I., Yamamura, K., Baba, H. and Ohmuraya, M.
  • Journal Title: Sci. Rep. Volume: 6 Pages: 37200
  • DOI: 10.1038/srep37200.
  • Peer Reviewed / Open Access / Int'l Joint Research
• [Journal Article] Short form FLICE-inhibitory protein promotes TNFalpha-induced necroptosis in fibroblasts derived from CFLARs transgenic mice. (2016)
  • Author(s): Shindo, R., Yamazaki, S., Ohmuraya, M., Araki, K. and Nakano, H.
  • Journal Title: Biochem. Biophys. Res. Commun. Volume: 480 Pages: 23-28
  • DOI: 10.1016/j.bbrc.2016.10.015. Epub 2016 Oct 6.
  • Peer Reviewed
• [Presentation] 哺乳類ミトコンドリアtRNAに存在する5-メチルシチジンの機能解析 (2016)
  • Author(s): 北川 翔，中野 沙緒里，鈴木 健夫，荒木 喜美，荒木 正健，鈴木 勉
  • Organizer: 第39回日本分子生物学会年会
  • Place of Presentation: 神奈川県横浜市（パシフィコ横浜）
  • Year and Date: 2016-11-30 – 2016-12-02
• [Presentation] p53により誘導されるLincRNA-p21の生体内発現解析 (2016)
  • Author(s): 古畑 理樹，中原 舞，伊東 春香，木戸 悠次郎，大村谷 昌樹，荒木 正健，吉信 公美子，山村 研一，荒木 喜美
  • Organizer: 第39回日本分子生物学会年会
  • Place of Presentation: 神奈川県横浜市（パシフィコ横浜）
  • Year and Date: 2016-11-30 – 2016-12-02
• [Presentation] Gene-trap mutagenesis is useful for analysis of long intergenic non-coding RNA genes in vivo. (2016)
  • Author(s): (14).Mai, Nakahara., Kumiko, Yoshinobu., Riki, Furuhata., Yujiro, Kido., Michihiko, Sugimoto., Ken-ichi, Yamamura., Masatake, Araki., and Kimi, Araki.
  • Organizer: 第39回日本分子生物学会年会
  • Place of Presentation: 神奈川県横浜市（パシフィコ横浜）
  • Year and Date: 2016-11-30 – 2016-12-02
• [Presentation] 常染色体優性遺伝性GH1遺伝子異常症の発症機序に関する検討－遺伝子置換システムを用いたヒト化GHマウスの作出－ (2016)
  • Author(s): 久保 英実香，有安 大典，荒木 喜美
  • Organizer: 第39回日本分子生物学会年会
  • Place of Presentation: 神奈川県横浜市（パシフィコ横浜）
  • Year and Date: 2016-11-30 – 2016-12-02
• [Presentation] 常染色体優性遺伝性GH1遺伝子異常症の発症機序に関する検討－ヒト化GHマウスを用いたin vivo解析－ (2016)
  • Author(s): 有安 大典，久保 英実香，芝田 晋介，荒木 喜美
  • Organizer: 第39回日本分子生物学会年会
  • Place of Presentation: 神奈川県横浜市（パシフィコ横浜）
  • Year and Date: 2016-11-30 – 2016-12-02
• [Presentation] CRISPR-Cas9を用いた遺伝子改変マウス作製 (2016)
  • Author(s): 荒木 喜美
  • Organizer: 第48回日本臨床分子形態学会総会・学術集会
  • Place of Presentation: 熊本県熊本市（くまもと県民交流館パレア）
  • Year and Date: 2016-09-23 – 2016-09-24
  • Invited
• [Presentation] CRISPR-Cas9とゲノム編集で解き明かす尾部退行症候群の発症メカニズム (2016)
  • Author(s): 仙波 圭，大場 隆，片渕 秀隆，飯田 有俊，池川 志郎，荒木 正健，荒木 喜美
  • Organizer: 第48回日本臨床分子形態学会総会・学術集会
  • Place of Presentation: 熊本県熊本市（くまもと県民交流館パレア）
  • Year and Date: 2016-09-23 – 2016-09-24
• [Presentation] Cre-driverマウスラインの樹立と解析（Cre-mER T2におけるタモキシフェンの投与方法について） (2016)
  • Author(s): 国場 訓，江藤 聡，荒木 美幸，森田 彩香，來海 葉子，山村 研一，吉信 公美子，荒木 喜美，荒木 正健
  • Organizer: 日本遺伝学会第88回大会
  • Place of Presentation: 静岡県三島市（日本大学）
  • Year and Date: 2016-09-07 – 2016-09-10
• [Presentation] p53により誘導されるLincRNA-p21の生体内発現解析 (2016)
  • Author(s): 古畑 理樹，中原 舞，伊東 春香，荒木 正健，吉信 公美子，山村 研一，荒木 喜美
  • Organizer: 日本遺伝学会第88回大会
  • Place of Presentation: 静岡県三島市（日本大学）
  • Year and Date: 2016-09-07 – 2016-09-10
• [Presentation] 染色体特異的にクラスターを形成しているトラップ領域（CSCT13）の解析 (2016)
  • Author(s): 荒木 正健，武田 伊世，大賀 俊範，江藤 聡，中原 舞，吉信 公美子，荒木 喜美
  • Organizer: 日本遺伝学会第88回大会
  • Place of Presentation: 静岡県三島市（日本大学）
  • Year and Date: 2016-09-07 – 2016-09-10
• [Presentation] CSCT2領域（3.1Mbp）欠損マウスラインの樹立 (2016)
  • Author(s): 大賀 俊範，武田 伊世，江藤 聡，中原 舞，吉信 公美子，荒木 喜美，荒木 正健
  • Organizer: 日本遺伝学会第88回大会
  • Place of Presentation: 静岡県三島市（日本大学）
  • Year and Date: 2016-09-07 – 2016-09-10
• [Presentation] Gene-trap mutagenesis is useful for analysis of long intergenic non-coding RNA genes in vivo (2016)
  • Author(s): Nakahara, M., Yoshinobu, K., Ito, H., Furuhata, R., Yamamura, K., Araki, M., Araki, K.
  • Organizer: The 2016 AMMRA & AMPC meeting
  • Place of Presentation: 神奈川県足柄下郡箱根町ホテルおかだ
  • Year and Date: 2016-05-20 – 2016-05-21
  • Int'l Joint Research
• [Remarks] 熊本大学 生命資源研究・支援センター 疾患モデル分野
  • URL: http://irda-genetics.kuma-u.jp/