Efforts toward precise and efficient homologous recombination in genome editing.

2018 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 16K07093
• Research Institution: Kumamoto University
• Principal Investigator: 荒木 喜美 熊本大学, 生命資源研究・支援センター, 教授 (90211705)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 荒木 正健 熊本大学, 生命資源研究・支援センター, 准教授 (80271609)
• Project Period (FY): 2016-04-01 – 2019-03-31
• Keywords: ゲノム編集 / ES細胞

Outline of Annual Research Achievements

CRISPR/Casを用いたゲノム編集は、遺伝子改変マウス作製において今や必要不可欠なツールである。しかし、我々は、特にマウスES細胞において、相同組み換えを誘発するためにCRISPR/Casによる2本鎖切断を行なった場合、目的とする相同組換え(HR)による変異導入に成功したアレルの対立アレルでは、大きなリアレンジがかなりの頻度で生じていることを発見した。我々は、ES細胞において、相同組み換えによってbeta-gal遺伝子が正確に挿入された場合のみX-gal染色陽性となり、リアレンジが起こるとX-gal染色陰性となる系を開発した。ES細胞では、通常、エレクトロポレーションでCas9とsgRNAの発現ベクターpX330とターゲティングベクターを同時に導入する手法を取っている。この系で、いくつかのNHEJやMMEJ阻害剤を検討したが、pX330プラスミドが存在する限り継続してCas9が発現するため、完全に抑制できるくらいの高濃度では細胞毒性が強く作用してしまい、最適条件を見出すことは困難であった。そこで、片方の鎖のみを切断するCas9 D10A nickaseの利用を検討した結果、２箇所以上同じストランドにnickを加えると、予想外に相同組み換えを誘発することがわかった。複数箇所のnickを加えるためには導入するプラスミドの数を増やすことになるので、エレクトロポレーションの条件も検討し、矩形波を用いることで効率を上昇させることに成功した。
受精卵における相同組み換えの系では、多くの受精卵を一度に扱うことのできるエレクトロポレーションの条件検討を行い、高い発生率で産仔を得ることができ、野生型Cas9を用いた場合には9割以上の効率で変異体を得ることができる条件を決定した。しかし、Cas9 D10A nickaseを用いた場合には効率よく相同組み換えを起こすことは難しかった。

Research Products

• [Journal Article] Inhibition of 15-PGDH causes Kras-driven tumor expansion through prostaglandin E2-ALDH1 signaling in the pancreas. (2019)
  • Author(s): Arima, K., Ohmuraya, M., Miyake, K., Koiwa, M., Uchihara, T., Izumi, D., Gao, F., Yonemura, A., Bu, L., Okabe, H., Imai, K., Hashimoto, D., Baba, Y., Chikamoto, A., Yamashita, Y. I., Furukawa, T., Araki, K., Baba, H. and Ishimoto, T.
  • Journal Title: Oncogene Volume: 38 Pages: 1211-1224
  • DOI: 10.1038/s41388-018-0510-y.
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] Loss of Endogenous HMGB2 Promotes Cardiac Dysfunction and Pressure Overload-induced Heart Failure in Mice. (2019)
  • Author(s): Sato, M, Miyata, K., Tian, Z., Kadomatsu, T., Ujihara, Y., Morinaga, J., Horiguchi, H., Endo, M., Zhao, J., Zhu, S., Sugizaki, T., Igata, K., Muramatsu, M., Minami, T., Ito, T., Bianchi, M.E., Mohri, S., Araki, K., Node, K., Oike, Y.
  • Journal Title: Circ. J. Volume: 83 Pages: 368-378
  • DOI: 10.1253/circj.CJ-18-0925.
  • Peer Reviewed / Int'l Joint Research
• [Journal Article] LPA5 signaling is involved in multiple sclerosis-mediated neuropathic pain in the cuprizone mouse model. (2018)
  • Author(s): Tsukahara, R., Yamamoto, S., Yoshikawa, K., Gotoh, M., Tsukahara, T., Neyama, H., Ishii, S., Akahoshi, N., Yanagida, K., Sumida, H., Araki, M., Araki, K., Yamamura, K., Murakami-Murofushi, K. and Ueda, H.
  • Journal Title: J. Pharmacol. Sci. Volume: 136 Pages: 93-96
  • DOI: 10.1016/j.jphs.2018.01.001.
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] Amyloid deposition in a mouse model humanized at the transthyretin and retinol-binding protein 4 loci. (2018)
  • Author(s): Li, X., Lyu, Y., Shen, J., Mu, Y., Qiang, L., Liu, L., Araki, K., Imbimbo, B.P., Yamamura, K., Jin, S. and Li, Z.
  • Journal Title: Lab Invest. Volume: 98 Pages: 512-524
  • DOI: 10.1038/s41374-017-0019-y.
  • Peer Reviewed / Int'l Joint Research
• [Journal Article] Differential Roles of Rad18 and Chk2 in Genome Maintenance and Skin Carcinogenesis Following UV Exposure. (2018)
  • Author(s): Tanoue, Y., Toyoda, T., Sun, J., Mustofa, M. K., Tateishi, C., Endo, S.,, Motoyama, N., Araki, K., Wu, D., Okuno, Y., Tsukamoto, T., Takeya, M., Ihn, H., Vaziri, C. and Tateishi, S.
  • Journal Title: J. Invest. Dermatol. Volume: 138 Pages: 2550-2557
  • DOI: 10.1016/j.jid.2018.05.015.
  • Peer Reviewed / Int'l Joint Research
• [Journal Article] Impact of loss-of-function mutations at the RNF43 locus on colorectal cancer development and progression. (2018)
  • Author(s): Eto, T., Miyake, K., Nosho, K., Ohmuraya, M., Imamura, Y., Arima, K., Kanno, S., Fu, L., Kiyozumi, Y., Izumi, D., Sugihara, H., Hiyoshi, Y., Miyamoto, Y., Sawayama, H., Iwatsuki, M., Baba, Y., Yoshida, N., Furukawa, T., Araki, K., Baba, H. and Ishimoto, T.
  • Journal Title: J Pathol. Volume: 245 Pages: 445-455
  • DOI: 10.1002/path.5098.
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] Differential expression of Lutheran/BCAM regulates biliary tissue remodeling in ductular reaction during liver regeneration. (2018)
  • Author(s): Miura, Y., Matsui, S., Miyata, N., Harada, K., Kikkawa, Y., Ohmuraya, M., Araki, K., Tsurusaki, S., Okochi, H., Goda, N., Miyajima, A. and Tanaka, M.
  • Journal Title: eLife Volume: 7 Pages: e36572
  • DOI: 10.7554/eLife.36572
  • Peer Reviewed / Open Access
• [Journal Article] Generation of and characterization of anti-IL-11 antibodies using newly established Il11-deficient mice. (2018)
  • Author(s): Deguchi, Y., Nishina, T., Asano, K., Ohmuraya, M., Nakagawa, Y., Nakagata, N., Sakuma, T., Yamamoto, T., Araki, K., Mikami, T., Tanaka, M. and Nakano, H.
  • Journal Title: Biochem Biophys Res Commun Volume: 505 Pages: 453-459
  • DOI: 10.1016/j.bbrc.2018.09.128.
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] Emergence of immunoregulatory Ym1+Ly6Chi monocytes during recovery phase of tissue injury. (2018)
  • Author(s): Ikeda, N., Asano, K., Kikuchi, K., Uchida, Y., Ikegami, H., Takagi, R., Yotsumoto, S., Shibuya, T., Makino-Okamura, C., Fukuyama, H., Watanabe, T., Ohmuraya, M., Araki, K., Nishitai, G. and Tanaka, M.
  • Journal Title: Sci Immunol. Volume: 3 Pages: eaat0207
  • DOI: 10.1126/sciimmunol.aat0207.
  • Peer Reviewed
• [Presentation] c-Maf過剰発現によって生じるT細胞分化異常の原因の究明 (2019)
  • Author(s): 昇地高雅、入江厚、高橋智、荒木喜美
  • Organizer: 第１回日本遺伝学会春季分科会
• [Presentation] Role of VPS52 During Early Mouse Delopment. (2019)
  • Author(s): Michihiko SUGIMOTO, Kimi ARAKI
  • Organizer: 2019 AMMRA & AMPC Meeting
  • Int'l Joint Research
• [Presentation] Motor protein myosinx is a novel regulatory factor for longitudinal bone growth and trabecular bone microstructures via the normal endochondral ossification in the growth plate. (2019)
  • Author(s): Taro Kataoka, Masaru Tamura, Akiteru Maeno, Toshihiko Shiroishi, Kimi Araki
  • Organizer: 2019 AMMRA & AMPC Meeting
  • Int'l Joint Research
• [Presentation] 可変型遺伝子トラップ法を用いた骨に影響を及ぼす新規遺伝子群の網羅的機能解析 (2018)
  • Author(s): 関本朝久、黒木修司、舩元太郎、永井琢哉、田島卓也、谷口昇、中原舞、吉信公美子、荒木喜美、荒木正健、帖佐悦男
  • Organizer: 第91回日本整形外科学会学術総会
• [Presentation] 骨表現型スクリーニングで選別したTmem161a欠損トラップマウスは明らかな骨量増加を呈する (2018)
  • Author(s): 永井琢哉、関本朝久、黒木修司、舩元太郎、田島卓也、谷口昇、中原舞、吉信公美子、荒木喜美、荒木正健、帖佐悦男
  • Organizer: 第91回日本整形外科学会学術総会
• [Presentation] 生体内におけるLincRNA-p21の機能解析 (2018)
  • Author(s): 古畑理樹、今坂 舞、藤川 遥平、荒木 正健、吉信 公美子、荒木 喜美
  • Organizer: 先端モデル動物支援プラットフォーム 若手支援技術講習会
• [Presentation] 遺伝子改変マウスを使って研究する時、手を抜いてはいけないこと (2018)
  • Author(s): 荒木喜美
  • Organizer: 先端モデル動物支援プラットフォーム 若手支援技術講習会
• [Presentation] コンディショナルノックアウトを効率良く行うためのタモキシフェン投与法の検討 (2018)
  • Author(s): 吉信公美子、荒木美幸、森田彩香、國場訓、荒木喜美、荒木正健
  • Organizer: 日本遺伝学会第90回大会
• [Presentation] 海綿骨構造と身長を制御するモータータンパク質Myosin10の機能解析 (2018)
  • Author(s): 片岡太郎、田村勝、前野哲輝、城石俊彦、荒木喜美
  • Organizer: 日本遺伝学会第90回大会
• [Presentation] Identification of responsible genes for Stmm 1 a locus conferring resistance to early-stage chemically induced skin tumors (2018)
  • Author(s): Kazuhiro Okumura, Megumi Saito, Eriko Isogai, Kimi Araki, Yuichi Wakabayashi
  • Organizer: 第77回日本癌学会学術総会
• [Presentation] The genetic polymorphism in p19Arf confersresistance to tumor progression (2018)
  • Author(s): Megumi Saito, Kazuhiro Okumura, Eriko Isogai, Kimi Araki, Yuichi Wakabayashi
  • Organizer: 第77回日本癌学会学術総会
• [Presentation] 可変型遺伝子トラップ法を用いた新規骨代謝関連遺伝子群の網羅的機能解析 (2018)
  • Author(s): 山口洋一朗 関本朝久 永井琢哉 舩元太郎 田島卓也 谷口昇 今坂舞 荒木喜美 吉信公美子 荒木正健 帖佐悦男
  • Organizer: 第33回日本整形外科学会基礎学術集会
• [Presentation] プロタミン2遺伝子改変マウスの作製と解析 (2018)
  • Author(s): 竹田直樹、小林千余子、荒木喜美
  • Organizer: 第41回日本分子生物学会年会
• [Presentation] マウスゲノムにおける遺伝子および転写産物の存在しない領域に集積するトラップクローンの探索 (2018)
  • Author(s): 齋藤 桂花、堤 成美、原田 実穂、吉信 公美子、荒木 喜美、荒木 正健
  • Organizer: 第41回日本分子生物学会年会
• [Presentation] Analyses of Tmem161a function in bone metabolism using the exchangeable gene trap mutagenesis show significant bone ingrowth. (2018)
  • Author(s): Nagai T, Sekimoto T, Kurogi S, Funamoto T, Tajima T, Imasaka M, Yoshinobu K, Araki K, Araki M, Chosa E
  • Organizer: Australian New Zealand Bone & Mineral Society Annual Scientific Meeting 2018
  • Int'l Joint Research