2017 Fiscal Year Research-status Report
ヒト化肝臓マウスを用いたヒト特異的肝毒性評価法の開発と毒性発症機序の種差の解明
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16K07102
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| Research Institution | Central Institute for Experimental Animals |
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Principal Investigator |
末水 洋志 公益財団法人実験動物中央研究所, 実験動物研究部, 部長 (40332209)
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| Project Period (FY) |
2016-04-01 – 2019-03-31
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| Keywords | ヒト肝キメラマウス / 肝毒性 / 薬剤性肝障害 / バイオマーカー |
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| Outline of Annual Research Achievements |
ヒト肝臓を生体内で再構築したHumanized-liver TK-NOGマウスを用いた薬剤性肝障害モデルでは、宿主マウス肝臓と再構築ヒト肝臓の両方が薬剤の影響を受け肝傷害が引き起こされることから、動物種特異的な肝毒性評価が行えると考えた。一般にALTやAST活性等の血液生化学検査により肝毒性が予測され、病理解析により評価されるが、酵素活性測定ではヒトALT活性とマウスALT活性を分別することはできない。一方、病理組織学ではヒト肝細胞とマウス肝細胞の傷害を区別することは可能であるが一個体の経時変化を観察することができない。そのため、経時的な肝毒性評価を可能とする「種特異的肝毒性評価法」の確立が必要となった。
初年度に確立した変性・壊死した肝細胞から漏出したアポA遺伝子mRNAをPCR法により検出する方法の感度を高めるためデジタルPCRによる分析を実施した。Humanized-liver TK-NOGマウス/チオアセトアミド肝毒性モデルについて血漿に逸脱したアポA遺伝子mRNAの検出を従来のリアルタイムPCR法とデジタルPCR法で比較したところ、低レベル領域ではデジタルPCR法が勝ることが確認できた。しかし、これらの方法は種特異性（Specificity）が高い一方、検出感度（Sensitivity）が低いことが問題になると考えられた。そこで、異なる分析手法として、血漿に逸脱するタンパクの種特異的検出を試みた。中間径フィラメント構成タンパク質のひとつであるサイトケラチンを標的としたキット（M65 EpiDeath ELISA）についてHumanized-liver TK-NOGマウス/チオアセトアミド肝毒性モデルを評価したところ、チオアセトアミド投与により血漿ヒトサイトケラチン18の上昇がHumanized-liver TK-NOGマウスのみで確認できた。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
初年度に確立した細胞傷害時に漏出するアポA遺伝子mRNA検出による種特異的肝毒性評価法では上昇したALT酵素活性に比し、検出した血漿mRNA量が僅かであった。本年度は低発現レベルでも定量性の良いデジタルPCR法にて分析を行った。はじめにアポA遺伝子mRNA検出用プライマー/TaqManプローブについて至適温度条件の設定、プローブの特異性を確認した。両プローブがデジタルPCR法でも良好に作動したことから、キメラ率約50%のHumanized-liver TK-NOGマウスを用いてチオアセトアミド誘導肝傷害モデルの評価を行い、リアルタイムPCR法による結果と比較を行った。マウスアポA遺伝子mRNAはリアルタイムPCR法でも比較良好に検出できたが、ヒトアポA遺伝子mRNAはほとんど検出することができなかった。一方、デジタルPCR法ではヒトアポA遺伝子mRNAを確実に検出し数値化することができた。しかし、その存在量はALT酵素活性に比し低く、種特異性（Specificity）は十分に確保できるものの検出感度（Sensitivity）は十分であるとは言い難いレベルであった。
一方、異なる分析手法により種特異的肝毒性評価を行うことも検討した。肝傷害に伴い血漿に逸脱するタンパクを種特異的に検出できるELISAキットとして中間径フィラメント構成タンパク質のひとつであるサイトケラチンを標的としたキット（M65 EpiDeath ELISA）を選択した。本キットはマウスと交差反応することなくヒト細胞から放出されるサイトケラチン18を特異的に検出できたことから、Humanized-liver TK-NOGマウス/チオアセトアミド肝毒性モデルについて評価したところ、チオアセトアミド投与により血漿ヒトサイトケラチン18の上昇がHumanized-liver TK-NOGマウスのみで確認できた。
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| Strategy for Future Research Activity |
初年度に確立したアポA遺伝子mRNAの種特異的検出法は高い種特異性を持って作動することがリアルタイムPCR機器に加えデジタルPCR機器でも確認できた。肝障害レベルが重度の場合、本法による検出は有効であるが肝傷害レベルが中～軽度の場合、十分な検出感度が得られないことが判明した。次年度は検出感度を上げる方法としてcDNAを均等に増幅するPreamplification法を試みる、あるいは、本年度着手した血漿に逸脱するタンパクの種特異的検出法について、サイトケラチン18以外のタンパクを標的とした ELISA法を試みる等により種特異性、検出感度とも良好な種特異的肝毒性評価法の確立をめざす。
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| Causes of Carryover |
本年度前半のデジタルPCR機器解析の結果を受け、後半にタンパクレベルでの解析に着手した。平行して作製していたHumanized-liver TK-NOGマウスを用いて肝毒性化合物投与を行い、ヒトタンパクを検出する新規のELISAにて測定する予定であったが、検体数を纏めて測定した方が効率的であることから、別の肝毒性化合物投与試験後の血漿採取と合わせて測定することにした。そのため、新規 ELISAの購入予算を次年度に繰り越した。
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Research Products
(1 results)
