2016 Fiscal Year Research-status Report
タンパク質シトルリン修飾酵素PADI2が大腸がんに果たす役割の解明
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16K07107
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| Research Institution | Tohoku University |
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Principal Investigator |
舟山 亮 東北大学, 医学系研究科, 助教 (20452295)
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| Project Period (FY) |
2016-04-01 – 2019-03-31
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| Keywords | シトルリン化 / PADI2 / 大腸がん / 翻訳後修飾 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
タンパク質シトルリン化酵素PADI2は大腸上皮組織に発現し、がん化の過程で発現量が低下する遺伝子である。本研究では、PADI2が大腸上皮細胞のがん化に果たす役割を解明することを目的として研究を実施した。平成28年度はまず、PADI2の研究をはじめるきっかけとなった、大腸がん組織のトランスクリプトーム解析の結果を論文発表した。また、「細胞レベルの解析」と「生化学的解析」の2つのアプローチにより、PADI2が大腸上皮細胞のがん化に果たす役割を調べた。
「細胞レベルの解析」では、大腸がん細胞株HCT 116にPADI2遺伝子を強制発現させて、in vitroで細胞の増殖能に与える影響を調べた。その結果、PADI2の発現は細胞内のシトルリン化タンパク質量を増加させるのと同時に細胞周期の進行をG1期で停止させること、この効果は酵素活性のないPADI2変異体では見られないことを明らかにした。すなわち、PADI2によるタンパク質のシトルリン化は細胞の増殖を抑制することを示した。しかし、PADI2発現株のヌードマウス移植実験ではPADI2による細胞増殖抑制効果は観察されず、PADI2が細胞のがん化を抑制する役割についてはさらに解析が必要である。
「生化学的解析」では、タンパク質中のシトルリン残基を認識する抗体を用いて、大腸組織に複数のシトルリン化タンパク質が存在することを見出し、これらがPADI2の基質タンパク質であると考えた。これらのタンパク質を同定するために抗シトルリン抗体を用いた免疫沈降を実施したが、シトルリン化タンパク質を沈降させることはできなかった。そこで、タンパク質中のシトルリン残基を特異的にビオチン標識する実験系を構築した。平成29年度は、この実験系を用いてPADI2の基質タンパク質を同定し、大腸組織におけるタンパク質シトルリン修飾の役割を解析する。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
PADI2は大腸上皮組織のがん化の過程で発現量が低下することから、PADI2によるタンパク質のシトルリン化は正常組織で細胞のがん化を抑制している、と考えた。PADI2の強制発現が大腸がん細胞株の増殖能を抑制した実験結果はこの仮説を支持しており、PADI2の果たすがん抑制機能を明らかにできたと考えている。この研究成果は現在、論文投稿中である。同時に本研究成果は、PADI2によるタンパク質のシトルリン化が細胞周期をどのように停止させるか、という新たな疑問を投げかけており、本研究分野の広がりが期待できる。
PADI2の基質タンパク質を同定する解析においては、用いた抗体が免疫沈降に適用できず、基質タンパク質の濃縮に利用できないという不運があった。しかし、並行して進めていた実験によりシトルリン化タンパク質を特異的にビオチン標識することが可能になった。この方法は特異性に制限のある抗体法よりも多くの種類のシトルリン化タンパク質を同定できる可能性を秘めており、基質タンパク質を見出すのにより適した実験系を構築できたと考えている。
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| Strategy for Future Research Activity |
PADI2によるタンパク質のシトルリン化は大腸がん細胞株の増殖能を抑制することを明らかにした。しかし、タンパク質のシトルリン化が細胞周期をどのように停止させるか、その分子機構は不明である。そこで本研究では、平成29年度に予定していたPADI2ノックアウトマウスの「個体レベルの解析」計画を変更し、PADI2の基質タンパク質の同定と細胞周期制御におけるその役割の解明を行う。
まず、ヒト大腸組織のタンパク質抽出液を用いて、シトルリン化タンパク質を特異的にビオチン標識する。平成28年度の研究の結果、タンパク質とビオチン標識 phenylglyoxal とを酸性条件下で反応させることにより、シトルリン残基を特異的にビオチン標識できることを確認した。ビオチン標識したタンパク質をアビジンビーズにより濃縮し、これを質量分析により調べ、シトルリン化タンパク質とその修飾部位を明らかにする。
ヒト大腸組織検体の解析は東北大学病院の研究者と協力して推進する。シトルリン化タンパク質の同定は、質量分析を専門とする研究者と共同で推進する。タンパク質立体構造の計算科学的解析を専門とする研究者と協力して、タンパク質の立体構造と安定性に影響するシトルリン修飾を計算科学的に予測し、これを生化学実験により検証する。
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| Causes of Carryover |
平成28年度に予定していたPADI2の基質タンパク質の解析にかかる経費を次年度に使用することにしたため。
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| Expenditure Plan for Carryover Budget |
PADI2の基質であるシトルリン化タンパク質の濃縮、質量分析、および組換えタンパク質作製などの生化学的解析に使用する。また、大腸がん細胞株の細胞培養に使用する培地やプラスチックウェアの購入に使用する。
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