2016 Fiscal Year Research-status Report

BACH1による腫瘍悪性化作用機序の解明

Research Project

Project/Area Number	16K07108
Research Institution	Tohoku University
Principal Investigator	松本光代東北大学, 医学系研究科, 助教 (80400448)
Project Period (FY)	2016-04-01 – 2019-03-31
Keywords	Bach1 / 癌 / 線維芽細胞
Outline of Annual Research Achievements	線維芽細胞は癌細胞によって局所的に悪性化に転化し、癌細胞の増殖を助けることが知られている。この局所的悪性型癌間質細胞は特に「cancer-associated fibroblasts (CAFs)」と呼ばれている。しかしながら、どのようにして癌間質線維芽細胞が悪性型への転化するのか、その機序は不明である。これまでに我々はin vitroにおいて転写因子Bach1欠損胎児線維芽細胞（MEFs）との共培養が乳がん細胞MCF-7の遊走性および浸潤性を野生型MEFsとの共培養と比較して亢進させること、また、ヌードマウスへのこれら細胞の共移植によって、Bach1欠損MEFsが癌細胞増殖を増強させることを見出している。これらの知見から、Bach1欠損線維芽細胞はより強力なCAFs様機能を発現するのではないかとの仮説を立て、Bach1欠損超免疫不全マウスを構築し、2016年度、本マウスへの癌細胞の移植実験を開始した。現段階の数種類の癌細胞移植において、仮説として考えていたほどの強力なCAFs様機能を見出すことはできていない。すなわち1×105 cells、1×106 cellsといった大量の癌細胞移植時において、癌細胞の増殖に差は見られていない。しかし、1×103 cellsといった少数細胞の移植時においては生着に差のある癌細胞の存在を確認しつつある。また、Bach1欠損MEFsと野生型MEFsのサイトカイン量をサイトカインアレイでみたところ、IL-6、SCFのみ野生型と比べ発現が高くなっていた。今後、癌細胞からの刺激を受けたMEFsにおける比較が必要である。Bach1は酸化ストレスやヘム量といった環境刺激によって変動するため、癌間質線維芽細胞におけるBach1を介した癌細胞への影響を知ることは癌細胞悪性化のコントロールに新たな知見を与えるきっかけとなることが期待される。
Current Status of Research Progress	Current Status of Research Progress 2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned. Reason 2016年度はBach1欠損超免疫不全マウスへの癌細胞株移植実験を予定通り開始し、またBach1欠損MEFsによる分泌サイトカインを評価した点において、概ね順調に進展したと評価する。しかしながら、今年度予定していたBach1欠損線維芽細胞における分泌サイトカインの評価として、癌細胞との共培養時のサイトカインのmRNAの発現量の評価はできていない。 2016年度の研究から、計画当初のBach1欠損超免疫不全マウスは強力なCAFs様機能を持ち、コントロールとなる超免疫不全マウスと比べ移植癌細胞の増殖を著しく促進するのではないかと考えていたが、その効果はマイルドであった。しかし、癌細胞の生着に必要な癌細胞数がBach1欠損超免疫不全マウスではより少なくてよいとのデータが得られており、Bach1欠損線維芽細胞が癌細胞の生着率を上げる可能性が示唆され、増殖の促進という面だけでなく、生着といった観点にも注目し今後の研究を進める予定である。
Strategy for Future Research Activity	今後、当初の研究計画通り、まずは「癌細胞を介した線維芽細胞のBACH1への影響」としてBach1欠損超免疫不全マウスへのヒト癌細胞株移植実験を引き続き行い、癌細胞からの刺激によって、線維芽細胞のBACH1の発現が変動するか調べる。 ①ヒト株化癌細胞とGFPを安定発現させた野生型MEF細胞を共培養し、共培養後の線維芽細胞におけるBACH１の発現をRT-qPCRおよびBACH1の抗体を用いたウエスタンブロッティング法をによって測定する。共培養の期間については、条件検討を行いながら、設定したいと考えている。②ヒト株化癌細胞とGFPを安定発現させた野生型MEF細胞を超免疫不全マウス（Bach1+/+）に共移植し、移植数ヶ月後、腫瘍塊を摘出する。摘出した腫瘍塊の一部をホルマリン固定し、線維芽細胞のBACH1の発現を抗BACH1抗体による組織免疫染色法によって調べる。③また、②の腫瘍塊の１部はコラゲナーゼを用いて溶解し、線維芽細胞をGFPでFACSを用いて分離し、RT-qPCRにてBach1遺伝子の発現量を測定する。採取できた細胞量が多ければ、ウエスタンブロッティングでもBACH1タンパク質を測定する。ただし、既知の報告から、発現変化の観察には長期期間を有する可能性があり、本解析に関しては、本研究期間の残り２年間に渡って解析を進めて行く。また、2017年度は2016年度に最後まで行えなかった「Bach1欠損による分泌サイトカインへの影響」をみる。①Bach1欠損型MEF細胞と野生型MEF細胞に癌細胞を共培養させ、その時のサイトカインmRNA発現レベルをRNA-seq法を用い、網羅的に解析することで関連サイトカインを同定する。