2016 Fiscal Year Research-status Report
がん治療を目指した遺伝子増幅の抑制の分子基盤の解明
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16K07121
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| Research Institution | Kagoshima University |
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Principal Investigator |
古川 龍彦 鹿児島大学, 医歯学域医学系, 教授 (40219100)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
井ノ上 逸朗 国立遺伝学研究所, 人類遺伝研究部門, 教授 (00192500)
河原 康一 鹿児島大学, 医歯学域医学系, 講師 (00400482)
南 謙太朗 鹿児島大学, 医歯学総合研究科, 特任研究員 (20735956)
山本 雅達 鹿児島大学, 医歯学域医学系, 助教 (40404537)
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| Project Period (FY) |
2016-04-01 – 2020-03-31
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| Keywords | 遺伝子コピー数変化 / 遺伝子増幅 / がん抑制遺伝子 / 抗がん剤耐性 / 遺伝子修復 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
テトラサイクリン誘導性のBHLHE41発現レンチウイルスの系を確立した。このウイルスをRRM1, MDR1の遺伝子増幅のある細胞株に感染し、経時的にゲノムのコピー数変化を観察した。誘導後に再現性のあるコピー数減少を確認した。現在最適なサンプル回収時期を決定するためにより短い時間での検討を開始した。
ストレプトタグ付加したBHLHE41発現ベクターを作成した。この分子を動物細胞に発現させて、結合タンパク質の同定について条件を検討中である。また、BHLHE41のKnockout細胞を作成し、遺伝子発現の変化についても解析中である。
N-myの増幅細胞株とc-mycのdouble minute, HSRそれぞれの形式の遺伝子増幅株細胞にBHLHE41を導入して強制発現している細胞についてmycのコピー数の変化を調べたが、軽度の減少は見られることもあったがmycのコピー数の減少を再現よく観察することはできなかった。ただし、mycはBHLHE41とDNA結合配列が重複しており特異な相互作用も考えられるので、増殖因子EGFRなど別の遺伝子増幅細胞を用いてさらに解析を行う。
ヒト肺がんでの免疫染色はすでに終了しており、染色の評価と発現と予後の解析の評価を行っている。今年度新たにBHLHE41発現によって肺がん細胞株では細胞数が減少することを見いだしたのでその機序についても解析中である。また、BHLHE41がユビキチン化を受けること、メチル化によって発現が抑制されていることについてのその可能性を見いだした。現在詳細については解析中である。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
初年度に当たり、観察対象の変化の経過が長いので条件検討にも時間を要している。しかし、この条件設定が結果を左右する最も重要な因子であること、また実際はより短い時間で変化が観察可能であることが確認できたので、今後は実験を加速できる条件がそろったと判断している。
一方、肺がん細胞での細胞数の減少などあらたな作用や遺伝子発現制御、タンパク質修飾などについて現象を見いだしており、ノックアウト細胞での遺伝子発現による解析など、当初計画された以外の機能についての解析も進める事ができた点もあることからほぼ順調な進行と判断した。
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| Strategy for Future Research Activity |
１．テトラサイクリン誘導性にBHLHE41を発現する細胞を単離しており、これらの細胞にドキシサイクリンを添加して、経時的に増幅遺伝子コピー数の低下を観察された採取時期に、上記に細胞からmRNAを単離してRNA-SeqやArray 解析を用いて、BHLHE41発現の誘導に伴って、発現の変化が起こる遺伝子を同定する。
２．テトラサイクリン誘導性のBHLHE41発現細胞からドキシサイクリン添加の後の細胞を用いて、経時的にのFISHを行い、染色体上の増幅遺伝子の変化を観察する。ゲノムDNAについてCGH arrayやSNPchip を用いて増幅遺伝子の範囲を決定するとともに、増幅時とコピー数減少後とのゲノムDNAの変化を捉える。
３．テトラサイクリン誘導性BHLHE41を導入し、ドキシサイクリンの存在によって、myc以外の増幅遺伝子のある細胞株を用いて、コピー数の減少が見られる細胞株を同定する。
４．臨床検体の解析とin silico解析を進める。
研究を推進するために、特に生物学的意義として１. ２．が最も大事であるので今年度はこの作業にある程度集中して取り組む。BHLHE41発現による肺がん細胞株では細胞数が減少についても、がん抑制遺伝子の働きと考えて解析をすすめ、コピー数の減少との接点を探る。さらに名古屋大学のグループとの共同研究を展開の予定であり、これによりBHLHE41との結合タンパク質の解析と遺伝子修復に関する先端的な情報を得ることが可能となったので、成果を上げるために研究を加速させる。
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| Causes of Carryover |
２８年度の計画実行の一部がずれ込んだために、購入予定を繰り上げて牛胎児血清を購入した。牛胎児血清の高騰もあり、少額の残額の結果となった。残額自体は１万円未満となったため２９年度に残すこととした。
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| Expenditure Plan for Carryover Budget |
発現解析やCHIPアッセイ、ＣＧＨアレイなどを予定しており、残高自体多くないので十分計画的に使用可能な範囲の金額であると想定している。
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[Journal Article] Thymidine Catabolism as a Metabolic Strategy for Cancer Survival2017
Author(s)
Tabata S, Yamamoto M, Goto H, Hirayama A, Ohishi M, Kuramoto T, Astushi Mitsuhashi A, Ryuji Ikeda R, Misako Haraguchi M, Kawahara K, Shinsato Y, Minami K, Saijo A, Hanibuchi M, Nishioka Y, Sone S, Esumi H, omita M, Soga T, Furukawa T, Akiyama S
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Journal Title
Cell Report
Volume: 19
Pages: 1313-1321
DOI
Peer Reviewed / Open Access / Acknowledgement Compliant
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[Journal Article] Filamin C promotes lymphatic invasion and lymphatic metastasis and increases cell motility by regulating Rho GTPase in esophageal squamous cell carcinoma.2017
Author(s)
Tanabe K, Shinsato Y, Furukawa T, Kita Y, Hatanaka K, Minami K, Kawahara K, Yamamoto M, Baba K, Mori S, Uchikado Y, Maemura K, Tanimoto A, Natsugoe S.
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Journal Title
Oncotarget
Volume: 8
Pages: 6353-6363
DOI
Peer Reviewed / Open Access / Acknowledgement Compliant
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[Presentation] 核小体の再編成により細胞分裂を制御する新たなストレス応答と癌治療薬の開発2016
Author(s)
下川倫子, 河原康一, 川畑拓斗, 上條陽平, 白石岳大, 山本雅達, 新里能成, 南謙太朗, 有馬一成, 濱田季之, 古川龍彦
Organizer
第８９回生化学会大会
Place of Presentation
仙台国際センター 東北大学川内北キャンパス（宮城県仙台市）
Year and Date
2016-09-25 – 2016-09-27
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