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2016 Fiscal Year Research-status Report

胞巣状軟部肉腫をモデルとした血行性転移機構の解明

Research Project

Project/Area Number 16K07131
Research InstitutionJapanese Foundation for Cancer Research

Principal Investigator

田中 美和  公益財団法人がん研究会, がん研究所 発がん研究部, 研究員 (70345883)

Project Period (FY) 2016-04-01 – 2019-03-31
KeywordsASPL-TFE3 / TFE3 / MiT/TFE family / 染色体転座 / キメラタンパク / 肉腫 / 血管新生 / 転移
Outline of Annual Research Achievements

1) ASPS細胞と血管周皮細胞の相互作用による血管新生機構の解析
ASPS細胞が分泌する血管周皮細胞遊走因子の探索を遂行した。ASPSの無血清培養上清をイオン交換カラムクロマトグラフィーにてタンパク質を精製・分画し、得られた各画分の生理活性能を血管周皮細胞に対する遊走能アッセイで確認した。次いで、活性画分に含まれるタンパク質を質量分析器(LC/MSMS)で同定し、機能予測と、解析済みのヒトとマウスASPSの遺伝子発現プロファイルと比較することで、ASPSにおける血管周皮細胞の新規遊走因子として抽出した。これらの因子をひとつずつsiRNAでノックダウンしたところ、血管周皮細胞の遊走活性能は減弱したが、消失には至らなかった。このことから、血管周皮細胞の遊走性の調節には、複数の因子が関与していることが示唆された。

2) 融合遺伝子ASPL-TFE3の機能解析と標的遺伝子の同定
ASPSの発症において、MiT/TFEファミリー (TFE3/TFEB/TFEC/MITF)の中で、TFE3とTFEB に共通の造腫瘍性ドメインが存在し、MITFとTFECには存在しないことをこれまでの実験で明らかにした。この結果から28年度は、造腫瘍性ドメインに結合する転写共役因子の同定を行った。Hisタグ付きのTFE3とMITFタンパク質を各々、ヒトASPS細胞の核抽出物と混合し、SDS-PAGEで分離後銀染色を行い、TFE3に特異的に共沈するタンパク質を精製、質量分析器にてアミノ酸配列を特定した。現在は、得られたタンパク質について、ヒトとマウスのASPS細胞で、ASPL-TFE3との結合の有無を免疫沈降実験により確認している。

Current Status of Research Progress
Current Status of Research Progress

3: Progress in research has been slightly delayed.

Reason

ASPS細胞が分泌する血管周皮細胞遊走因子の候補は同定できたが、候補因子をノックダウンした際の遊走活性化能が顕著に減少しないので、候補は複数なのか、他に見落としている可能性も考えられる。
また、血管形成の過程を明らかにするため、血管周皮細胞の遊走をひとつの指標としたが、別のアッセイ方法での検証も必要である。

Strategy for Future Research Activity

1) ASPS細胞と血管周皮細胞の相互作用による血管新生機構の解析
ASPS細胞が分泌する血管周皮細胞遊走因子の候補は抽出できたが、複数候補の関与が示唆されたことから、複数の遺伝子導入による過剰発現やsiRNAによるノックダウンで、血管周皮細胞及び血管内皮細胞の遊走能をin vitroで評価する。血管形成の過程を明らかにするため、血管周皮細胞の遊走能を指標に解析を進めてきたが、新たな評価方法として、ASPS細胞と血管周皮細胞との接着や、血管周皮細胞及び血管内皮細胞の増殖能を指標とした新たなアッセイ系を構築する。再度、プロテオミクス情報と機能予測、遺伝子発現アレイ解析結果から予想されるサイトカインやケモカインなどを見直し、それら分泌タンパク質の関与についての検討も進める。
上記より得られた候補因子について、in vitroで検証した後に、shRNAや抗体・阻害剤の投与により、マウスASPSでの新たな血管新生の縮小や、転移巣の減少をin vivoで評価する。

2) 融合遺伝子ASPL-TFE3の機能解析と標的遺伝子の同定
ヒト・マウスASPS細胞で、ASPL-TFE3と共役因子の結合を免疫沈降実験により確認した上で、ASPL-TFE3の欠失変異体を作製して結合モチーフを同定する。

  • Research Products

    (9 results)

All 2017 2016

All Journal Article (3 results) (of which Int'l Joint Research: 1 results,  Peer Reviewed: 3 results,  Acknowledgement Compliant: 3 results,  Open Access: 1 results) Presentation (6 results) (of which Invited: 2 results)

  • [Journal Article] CIC-DUX4 induces small round cell sarcomas distinct from Ewing sarcoma.2017

    • Author(s)
      Yoshimoto T, Tanaka M, Homme M, Yamazaki Y, Takazawa Y, Antonescu CR, Nakamura T.
    • Journal Title

      Cancer Research

      Volume: 印刷中 Pages: 印刷中

    • DOI

      10.1158/0008-5472.CAN-16-3351

    • Peer Reviewed / Acknowledgement Compliant
  • [Journal Article] Modeling Alveolar Soft Part Sarcoma Unveils Novel Mechanisms of Metastasis.2017

    • Author(s)
      Tanaka M, Homme M, Yamazaki Y, Shimizu R, Takazawa Y, Nakamura T.
    • Journal Title

      Cancer Research

      Volume: 77(4) Pages: 897-907

    • DOI

      10.1158/0008-5472.CAN-16-2486.

    • Peer Reviewed / Acknowledgement Compliant
  • [Journal Article] Combined experience of six independent laboratories attempting to create an Ewing sarcoma mouse model.2016

    • Author(s)
      Minas TZ, Surdez D, Javaheri T, Tanaka M, Howarth M, Kang HJ, Han J, Han ZY, Sax B, Kream BE, Hong SH, Celik H, Tirode F, Tuckermann J, Toretsky JA, Kenner L, Kovar H, Lee S, Sweet-Cordero EA, Nakamura T, Moriggl R, Delattre O, Uren A
    • Journal Title

      Oncotarget

      Volume: May Pages: 15

    • DOI

      10.18632/oncotarget.9388.

    • Peer Reviewed / Open Access / Int'l Joint Research / Acknowledgement Compliant
  • [Presentation] miR-214は腫瘍性マクロファージ(TAM)の産生を介して滑膜肉腫を悪性化する2017

    • Author(s)
      田中美和、山崎ゆかり、本目みずき、中村卓郎
    • Organizer
      平成27年度 先端モデル動物支援プラットフォーム成果発表会
    • Place of Presentation
      大津市
    • Year and Date
      2017-02-06 – 2017-02-07
  • [Presentation] 軟部肉腫におけるペリサイトを介した血管新生・転移機構2016

    • Author(s)
      田中美和、山崎ゆかり、本目みずき、清水六花、中村卓郎
    • Organizer
      第39回 日本分子生物学会年会
    • Place of Presentation
      横浜市
    • Year and Date
      2016-11-30 – 2016-12-02
  • [Presentation] ユーイング肉腫とユーイング類縁肉腫の動物モデル開発 ―難治性がんの治療法開発に向けた評価系―2016

    • Author(s)
      田中美和、本目みずき、清水六花、吉本豊毅、山崎ゆかり、中村卓郎
    • Organizer
      第19回 癌と骨病変研究会
    • Place of Presentation
      東京都
    • Year and Date
      2016-11-11 – 2016-11-11
    • Invited
  • [Presentation] The molecular mechanism of hematogenous metastasis in alveolar soft part sarcoma.2016

    • Author(s)
      Miwa Tanaka, Yukari Yamazaki, Mizuki Homme, Rikuka Shimizu, Takuro Nakamura
    • Organizer
      第75回 日本癌学会学術総会
    • Place of Presentation
      横浜市
    • Year and Date
      2016-10-06 – 2016-10-08
  • [Presentation] 胞巣状軟部肉腫をモデルとした血行性転移の分子機構2016

    • Author(s)
      田中美和、山崎ゆかり、本目みずき、清水六花、中村卓郎
    • Organizer
      第25回 日本がん転移学会学術集会・総会
    • Place of Presentation
      鳥取市
    • Year and Date
      2016-07-21 – 2016-07-22
    • Invited
  • [Presentation] 骨軟部肉腫におけるマイクロRNA発現の特徴2016

    • Author(s)
      田中美和、山崎ゆかり、本目みずき、中村卓郎
    • Organizer
      第105回 日本病理学会総会
    • Place of Presentation
      仙台市
    • Year and Date
      2016-05-12 – 2016-05-14

URL: 

Published: 2018-01-16  

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