悪性脳腫瘍におけるP5の機能的役割および新規分子標的としての有用性に関する研究

2017 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 16K07170
• Research Institution: Kyoto University
• Principal Investigator: 堀部 智久 京都大学, 医学研究科, 特定准教授 (20467468)
• Project Period (FY): 2016-04-01 – 2019-03-31
• Keywords: タンパク質 / 分子シャペロン / 癌 / 発光イメージング / ケミカルバイオロジー

Outline of Annual Research Achievements

本研究では、細胞内のタンパク質の正しい折りたたみに重要なジスルフィド結合の形成、還元、異性化を触媒し、また、誤って折りたたまれたタンパク質の介助を担う、シャペロン活性も有するプロテインジスルフィドイソメラーゼ（PDI）の関連タンパク質の一つであるPDIP5の悪性脳腫瘍細胞内における機能的な役割の解明を行い、悪性脳腫瘍においてP5を標的とすることの有用性をおよび新たな抗癌標的療法の可能性を提示することを目的としている。平成29年度は、主に下記の研究内容を行った。
(1)一細胞レベル発光/蛍光同時リアルタイムイメージング手法による悪性脳腫瘍細胞内のP5の機能解析
H28年度に悪性脳腫瘍細胞内でP5と結合することが同定されたタンパク質と蛍光タンパク質を融合させた発現ベクターおよび小胞体ストレスのマーカータンパク質のプロモーターレポーターベクターを悪性脳腫瘍細胞に安定的に発現させる安定発現細胞株を樹立した後、LV200システムを用いた一細胞レベル発光/蛍光同時リアルタイムイメージングを行った。コントロールと比較して、siRNAによるP5のノックダウンでは、悪性脳腫瘍細胞の形態変化や細胞増殖および上記プロモータの活性化に影響を及ぼす可能性が示唆された。
(2)P5のバリアントに関する機能解析
シグナル配列の長さが異なる複数のP5のバリアントの存在が確認されており、これらバリアントの機能解析を行うために、RT-PCRによる発現確認を行った。その結果、悪性脳腫瘍細胞では、2種類のバリアントが発現している可能性が示唆された。また、これらバリアントとNanoLucを融合した発現ベクターを構築し、悪性脳腫瘍細胞株に一過性にトランスフェクションを行い、一細胞レベル発光イメージングによる可視化を試みた。その結果、これらタンパク質の発現を観察可能であることが確認された。

Current Status of Research Progress

2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.

Reason

H29年度に予定していた、一細胞レベルでの発光イメージングに必要な細胞株や発現ベクターの構築も順調に進み、発光イメージング手法によりいくつかの良好な結果が得られているため、ここまでおおむね順調に進行していると思われる。

Strategy for Future Research Activity

悪性脳腫瘍細胞内におけるP5のバリアントのさらなる機能解析を一細胞レベル発光イメージング手法等を用いて行う。また、活性阻害剤と既存の抗癌剤との併用による効果の検証を行い、分子標的としての有用性を評価していく予定である。

Causes of Carryover

(理由)
H29年度に予定していたsiRNA、細胞培養用試薬、イメージングに必要な各種試薬などの消耗品を当初予定していたよりもおさえることができたため、また、イメージング解析に必要な各種材料（発現ベクターなど）も順調に構築が行えたために、これら実験に予定していた諸費用もおさえることができた。
(使用計画)
H30年度の研究費の使用としては、主に次の項目で使用予定である。細胞の増殖の影響を調べるための生細胞測定試薬類および各種キット類、一細胞レベル発光イメージングによる測定および解析を行う際に必要不可欠な発光用（基質含む）試薬類および各種消耗品、さらには、動物購入、保守費用、細胞培養関連および維持管理に必要な消耗品、関連器具類。その他、実験補助員費用や研究成果発表（学会など含む）および打ち合わせのための費用（旅費等）を予定している。