試験管内分子進化技術を用いた癌免疫療法のための中分子創薬研究

2017 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 16K07182
• Research Institution: St. Luke's International University
• Principal Investigator: 平家 勇司 聖路加国際大学, 専門職大学院公衆衛生学研究科(公衆衛生大学院), 教授 (90260322)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 久保 泰 国立研究開発法人産業技術総合研究所, 生命工学領域, 副研究センター長 (10178030) ; 五島 直樹 国立研究開発法人産業技術総合研究所, 生命工学領域, 研究チーム長 (70215482)
• Project Period (FY): 2016-04-01 – 2019-03-31
• Keywords: がん免疫療法 / 免疫チェックポイント阻害剤

Outline of Annual Research Achievements

研究計画に記載したごとく、既に構築されている3-finger protein libraryの試験官内進化技術を用い、PD-1と特異的に結合する3-finger proteinをスクリーニングし、特定のアミノ酸配列に収斂したことを確認した。具体的には、この選択サイクルを10回実施し、全体のcDNAの36％を占めるcDNAを2種類クローニングした。次にこのcDNAクローンから合成される3-finger proteinの機能アッセイを行うべく、まずその3-finger proteinの大量合成系の構築に着手した。得られたcDNAクローンを鋳型とし、split PCR法を用いて、cDNAクローンの5‘側にSP6プロモーター配列、オメガ配列、コザック配列を、3’側にpoly a take配列を付与したDNAを合成した。そのcDNAを用い、in vitroの転写系にてRNAを合成した。そして、そのRNAを鋳型として、小麦胚芽タンパク合成系にて、3-finger proteinを合成した。しかしながら、2種類のクローンのうち、一方のクローンは十分量のタンパク合成量が得られなかった。RNA合成までは可能であったため、翻訳効率の低いアミノ酸配列を有すると考えられた。そのためtotal 3-finger protein翻訳方法の工夫（小麦胚芽合成系へのdetergentの添加、反応温度など）を検討することに加え、個々のfingerのペプチド（One-finger peptide）を化学合成し、それぞれの機能を調べる方針とした。取得した合成ペプチドは、十分な純度を確保するため逆相カラムによるHPLC精製を行い、ヒトリンパ球を用いたPD-1のin vitro機能アッセイにより候補ペプチドのアゴニスト/アンタゴニスト活性評価を行う。

Current Status of Research Progress

3: Progress in research has been slightly delayed.

Reason

6種類のOne-finger peptideをHPLCや質量分析により純度検定したところ、想定以上の副産物や酸化・還元状態の混合が認められたため、精製分離に時間を要した。

Strategy for Future Research Activity

タンパク質合成系の至適化のための条件検討（小麦胚芽無細胞タンパク質合成系への界面活性剤の添加、合成温度や融合タグの検討、透析法による長時間合成など）を行い、候補となる2種類の3-Fingerタンパク質を調製するとともに、高純度One-finger peptide（6種類）を取得する。これらを用いて、SPR法（Biacore等による測定）によるPD-1との相互作用解析および培養細胞を用いたPD-1/PDL-1アッセイによるタンパク質/ペプチドの生物活性評価を実施する。

Causes of Carryover

（理由）
研究計画がやや遅れている状況であり、次年度に繰り越した実験があるため。
（使用計画）
次年度に繰り越した実験に使用する物品を購入するため。