Discovery research of medium molecule drugs for cancer immunotherapy using in vitro molecular evolution technology

2018 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 16K07182
• Research Institution: St. Luke's International University
• Principal Investigator: 平家 勇司 聖路加国際大学, 専門職大学院公衆衛生学研究科(公衆衛生大学院), 教授 (90260322)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 久保 泰 国立研究開発法人産業技術総合研究所, 生命工学領域, 副研究センター長 (10178030) ; 五島 直樹 国立研究開発法人産業技術総合研究所, 生命工学領域, 研究チーム長 (70215482)
• Project Period (FY): 2016-04-01 – 2019-03-31
• Keywords: PD-1 / 3-finger protein / 小麦胚芽蛋白合成系 / 合成ペプチド

Outline of Annual Research Achievements

2017年度までに、3-finger protein libraryの試験管内進化技術を用いてPD-1と特異的に結合する3-finger protein２種類をスクリーニングした。得られたcDNAクローンにSP2プロモーター配列、オメガ配列、コザック配列及びpoly A シグナル配列を付与したDNAを合成し、小麦胚芽蛋白合成系にて3-finger proteinを合成を試みたものの、十分量のペプチドは得られなかった。2018年度は、タンパク質合成系の至適化のための条件検討（小麦胚芽無細胞タンパク質合成系への界面活性剤の添加、合成温度や融合タグの検討、透析法による長時間合成など）を行い、候補となる当該タンパク質の調製を進めている。
並行して、研究計画に記載のとおり3-fingerからdown-sizingしたOne-fingerペプチドの取得と機能解析を行った。前述の2種類の3-finger proteinに由来する合計6種類のOne-finger peptideの調製は化学合成法と逆相カラムHPLC法により高純度One-finger peptideを取得した。それぞれのOne-finger peptideについて、ヒトリンパ球を用いたPD－１のin vitro機能アッセイによりそのアゴニスト/アンタゴニスト活性評価を試みた。即ち、PD－１を発現するエフェクター細胞（レポーター）とPD―L1/PD-L2およびTCRアクティベータを発現する細胞との機能阻害（促進）効果を計測した。しかし、合成したOne-finger peptideいずれも、PD－１の生物学的機能には影響を及ぼさなかった。さらに、その混合物でもPD-1の機能に影響を与えなかった。
結論：現時点で得られているPD-1に対する3-finger peptideは、結合能はあるものの生物学的活性は確認できなかった。