2016 Fiscal Year Research-status Report
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16K07199
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| Research Institution | Osaka University |
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Principal Investigator |
永森 一平 大阪大学, 医学系研究科, 助教 (20624729)
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| Project Period (FY) |
2016-04-01 – 2019-03-31
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| Keywords | エピジェネティクス / piRNA / DNAメチル化 / 生殖細胞 / ヒストン修飾 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
本研究課題における目的は生殖細胞特異的な小分子RNAであるpiRNA（PIWI-interacting RNA）によるDNAメチル化導入機構の解明である。申請者の予備的な成果から、piRNA依存的にDNAがメチル化される領域にはDNAのメチル化を阻害するヒストン修飾であるH3K4me2（4番目のリシンがジメチル化されたヒストンH3）が多く局在していることを見出していた。そこで、piRNA依存的なDNAメチル化機構は単にDNAメチル化酵素によるものではなく、DNAメチル化を阻害するH3K4me2の除去であり、DNAメチル化はその結果二次的に誘導されるものである可能性を検証している。
piRNA結合タンパク質であるMIWI2（Mouse PIWI2）は核内へ移行すること、この核内移行に異常が生じる遺伝子改変マウス、及びMiwi2欠損精巣ではpiRNA依存的なDNAメチル化が誘導されないことから、MIWI2複合体がpiRNA依存的なDNAメチル化に必須であると考えられている。もしMIWI2複合体によるH3K4me2の消去がpiRNA依存的なDNAメチル化に必須なのであれば、Miwi2欠損細胞において、piRNA依存的な領域においてのみ、H3K4me2の増加が観察されるはずである。本年度では、Miwi2欠損細胞を用いてH3K4me2の局在をゲノムワイドに解析した。その結果、Miwi2欠損細胞では、H3K4me2の発現量が減少する領域は極少数であったが、増加する領域が5000以上あることを見出した。これらの領域の大部分はpiRNA依存的なDNAメチル化を受ける領域であった。以上のことから、本年度に得られた成果は当初の仮説と矛盾のないものであった。現在、これらのH3K4me2の消去がpiRNA依存的なDNAメチル化に必須であるか、その因果関係の検証を試みている。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
Miwi2依存的なH3K4me2の脱メチル化とpiRNA依存的なDNAメチル化の相関関係の検証を下記の通り、ほぼ完了した。コントロール及びMiwi2欠損マウスの精巣から、Oct4-GFP陽性の精原細胞を回収し、H3K4me2抗体を用いたChIP-seq解析を行った。これにより、約70,000のピークを同定し、その中の約5,000のピークがMiwi2欠損細胞において、正常細胞よりも4倍以上増加していた。次にこれらのH3K4me2の発現量とpiRNA依存的なDNAメチル化の変化を比較するために、H3K4me2ピーク上におけるDNAメチル化率を抽出した。その結果、Miwi2欠損細胞でH3K4me2が増加する領域の大部分はpiRNA依存的なDNAメチル化を受ける領域であった。一方で、DNAメチル化の消失がH3K4me2の増加に繋がっている可能性も否定できていなかったため、この点も検証した。まず全ゲノムを500bpのサイズに分割し、piRNA依存的にDNAがメチル化される領域を約14,000同定した。これらの中で、Miwi2欠損細胞におけるH3K4me2の変化±2倍以下のものが約10,000あることを確認した。すなわち、piRNA依存的にDNAがメチルされなかった領域の全てにおいて、H3K4me2が増加しているわけではないことを示している。以上の結果から、Miwi2依存的なH3K4me2の消去がpiRNA依存的なDNAメチル化に必要である、という申請者の仮説と矛盾のないもであった。又、MIWI2は培養細胞において、H3K4me2脱メチル化酵素であるKDM1A（Lysine demethylase 1a）と強く結合することを見出している。MIWI2-KDM1A依存的なH3K4me2の消去がpiRNA依存的なDNAメチル化に繋がるか、その因果関係の検証を試みている。
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| Strategy for Future Research Activity |
MIWI2複合体によるH3K4me2の脱メチル化がDNAメチル化に必須であるかを検証する。この目的のために、１）胎生期精巣の器官培養、２）dCas9-MIWI2による人為的DNAメチル化導入法の確立、の二つの手法からアプローチを行う。
胎生期精巣の器官培養では、まずpiRNA依存的なDNAのメチル化が生じる直前の胎生期精巣を2－3日間培養し、生体内と同様にDNAがメチル化されるかを観察する。次に、MIWI2結合H3K4me2脱メチル化酵素であるKDM1Aの阻害剤存在下で培養することで、piRNA依存的なDNAメチル化に変化があるかを検証する。必要に応じて、全ゲノムにおけるDNAメチル化の変化を包括的に解析する。これと同時に、培養後の胎生期精巣から生殖細胞を回収し、H3K4me2の変化を観察する。以上の実験から、MIWI2結合KDMであるKDM1a依存的なH3K4me2の脱メチル化がpiRNA依存的なDNAメチル化に必要であるか、を検証する。
dCas9-MIWI2による人為的なDNAメチル化導入法の確立では、293t細胞において、dCas9-MIWI2を人為的に特定の領域へリクルートすることで、H3K4me2の消去とDNAメチル化の獲得がおきるか、を観察する。標的としてはdCas9でDNAメチル化酵素の触媒ドメインをリクルートすることで、DNAメチル化が獲得されるBACH2領域をモデルとして用いる。
上記の二つの手法を並行して進めることで、MIWI2-piRNA複合体依存的なDNAメチル化の分子機構の解明を試みる。
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Research Products
(3 results)
