2016 Fiscal Year Research-status Report
ホモプラズミックなミトコンドリアゲノム改変細胞ライブラリーの創出
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16K07207
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| Research Institution | Institute of Physical and Chemical Research |
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Principal Investigator |
和田 健一 国立研究開発法人理化学研究所, 前田バイオ工学研究室, 協力研究員 (20525919)
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| Project Period (FY) |
2016-04-01 – 2019-03-31
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| Keywords | マイクロ流体デバイス / ミトコンドリア移植 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
ミトコンドリア（mt）ゲノムはエネルギー産生を中心としたミトコンドリアの機能に必須であるが、実用的な改変技術が開発されていないためにその機能解析の実施が大きく制限されている。そこで本研究ではmtゲノムの機能解析の実施に貢献する研究プラットフォームの構築を目指して、1）ホモプラズミックなmtゲノム改変技術の創出、および、2）mtゲノム変異細胞株ライブラリーの構築、という二つの連続した研究課題を設定した。
前半の研究課題では、申請者の独自技術であるマイクロ流体デバイスを利用したミトコンドリア移植技術によってmtゲノム欠失細胞（ρ0細胞）に対する単一ミトコンドリアの移植を実現し、mtゲノムのクローニング、およびそれに引き続くmtゲノムのホモプラズミーを構築する技術基盤を確立する。
後半の研究課題では、前半の研究課題で開発した（する予定である）ホモプラズミックなmtゲノム改変技術を用いて可能な限り多くの種類のmtゲノム改変細胞株を樹立することで、mtゲノムの解析に寄与するmtゲノム改変細胞ライブラリーを構築することを目指す。具体的には、単一ミトコンドリアの移植によってランダムにmtゲノム変異が蓄積した細胞からmtゲノムをクローニングし種々のホモプラズミックなmtゲノム変異を有した細胞株を得ることで、mtゲノム改変細胞ライブラリーを構築する。この研究課題では、大規模なライブラリーを構築するためにmtゲノム改変細胞樹立のスループットを上げるための技術の開発も同時に実施する。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
研究計画初年度である平成28年度は、前半の研究計画として設定したホモプラズミックなmtゲノム改変技術の開発に取り組んだ。現在のところ、ホモプラズミックなmtゲノム改変の成功には至っていないが、本研究で提案したmtゲノム改変技術において最も重要な要素技術である単一ミトコンドリア移植がモデル細胞を用いた実験において既に実現していることに加え、mtゲノム改変を実現するために必要なその他の要素技術の開発、材料の準備が整いつつあるため、研究はおおむね順調に進捗していると考えている。以下に、それらの概略を記す。
1）ミトコンドリア移植細胞回収法の開発： ドナー細胞をvirus thymidine kinase (TK)発現細胞とすることで、GCVを用いたTKの陽性選別によるドナー細胞由来核を有する細胞の除去を可能にした。これにρ0細胞の栄養要求性を利用した選別を加えることで、ミトコンドリアが移植されたρ0細胞のみを回収できる選別法を構築した。現在までに、GCVによるドナー細胞由来核を有した細胞の選択的除去の条件を決定しこの選別が良好にワークすることを確認している。
2）ドナー細胞の樹立： 本研究計画で提案しているmtゲノム改変法の実証実験に用いる2種類のmtゲノムをヘテロプラズミックに有するドナー細胞を樹立した。これに付随して、これらのmtゲノムの遺伝子型を制限酵素消化を用いて簡便に同定できる方法を構築した。
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| Strategy for Future Research Activity |
現在のところ、本研究計画の中核であるホモプラズミックなmtゲノム改変は成功に至っていない。主たる原因として、移植されたミトコンドリアの定着、およびその選別における効率の悪さが想定される。平成29年度はこれらに対する改善方法を検討し、2種類のmtゲノムをヘテロプラズミックに有するモデルドナー細胞からのmtゲノムのクローニングの実現を目指す。具体的には、以下の三つのアプローチを計画している。
1）ミトコンドリア移植条件の至適化： これまでに、独自開発したマイクロデバイスを用いた新規細胞融合法によってモデル細胞として用いたNIH3T3細胞に対して単一ミトコンドリアの移植に成功している。しかし、同一条件にてρ0細胞に対する単一ミトコンドリアの移植を試みたが、今のところその実現には至っていない。そこで、ρ0細胞に対して単一ミトコンドリア移植を高効率で実現する条件（マイクロデバイス形状、細胞培養条件、等）の至適化を行う。
2）細胞増殖速度の抑制： ρ0細胞に対する単一ミトコンドリアの移植が実現できたとしても、細胞増殖速度がmtゲノムの複製速度を上回っている場合は、導入されたmtゲノムがρ0細胞内に蓄積することができず最終的には消失してしまうことが想定される。そこで、細胞増殖を阻害する種々の条件を用いることで、移植ミトコンドリア由来のmtDNAのρ0細胞内への蓄積を促進することを試みる。
3）選別条件の至適化： 現在、ミトコンドリア移植が成立したρ0細胞の選別は、GCVを用いた陽性選別とρ0細胞の栄養要求性に依存した陰性選別を組み合わせて実施している。特に後者は対象としたρ0細胞にmtゲノムが十分に蓄積しなければ良好にワークしないことが予想される。そこで、この選別を実施するための実験条件の至適化を行う。
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| Causes of Carryover |
購入予定であった実験機器が使用可能となった為、当該機器の購入費を次年度の研究実施分に繰り越すこととした。
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| Expenditure Plan for Carryover Budget |
平成29年度は引き続き本研究計画の中核であるホモプラズミックなmtゲノム改変技術の開発を進める。これに必要な、試薬、消耗品等の購入費として当該助成金を使用する予定である。これに加えて、平成29年度はmtゲノム改変改変技術開発の進展に伴い、mtゲノム改変を実施した細胞株がいくつか得られることが期待される。これらの細胞のmtゲノムの委託解析費としても使用を予定している。
平成28年度からの繰越額は、ミトコンドリア移植をハイスループット化するための新規マイクロデバイスの設計・作製費として使用する予定である。
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