Development of Hydrogel Microcapsule for Single Cell Genomics

2016 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 16K07224
• Research Institution: Institute of Physical and Chemical Research
• Principal Investigator: 青木 弘良 国立研究開発法人理化学研究所, 光量子工学研究領域, 研究員 (50518636)
• Project Period (FY): 2016-04-01 – 2020-03-31
• Keywords: 一菌体ゲノム解析 / ハイドロゲルマイクロカプセル / 難培養微生物 / 全ゲノム増幅 / 増幅バイアス

Outline of Annual Research Achievements

環境中の多くの微生物は，周囲の微小環境 (niche) に適応し，複雑な培養条件を必要とするため，実験室内での培養が困難な，難培養微生物 (Yet-Unculturable Microorganism, YUM) である．従来YUMの機能は未知であったが，近年環境試料中のDNAをPhi29 DNA Polymeraseを用いた全ゲノム増幅 (Whole Genome Amplification, WGA) し，次世代シーケンサーで遺伝子解析するメタゲノム解析により，その機能が徐々に明らかになりつつある．しかしメタゲノム解析は，微生物の混合物を解析するため，個々の微生物の機能の解析が困難であった．そのため菌体を物理的に単離し，ゲノム解析する一菌体ゲノム解析 (Single Cell Genomics) が試みられたが，(1) 菌体が数 umと微細なため，単離が困難，(2) 他の菌体やDNAの混入（コンタミ）による，目的微生物の塩基配列データ数の減少，および (3) 一菌体に含まれるDNA量がごく微量なため，酵素により不均一に増幅され，バイアスが生じる，などの課題があった．
そこでこれらの技術的な課題を解決するため，内部に単一の菌体を包埋し，外側をアガロースゲルの殻で覆った，アガロースゲルマイクロカプセル (AGM) の開発を試みた．AGMは菌体の周囲を直径数10 umのアガロースゲルのシェルで覆うことで，(1) 物理的単離を容易にし，(2) アガロースシェルによって，コンタミを防ぎつつ，酵素反応溶液を内部に拡散させ，(3) 内部の微細空間内での酵素反応による，増幅バイアルの抑制，を図った．

Current Status of Research Progress

2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.

Reason

これまでコアとなるアルギン酸ゲルマイクロビーズとシェルを形成するアガロースゾルの懸濁液を，注射針を用いたミネラルオイルのシース流を用いてエマルジョン化し，冷却によりゲル化した後，EDTAによるアルギン酸のゾル化によりAGMが作製された (Sakai S, 2008)．しかし作業工程や，器具を介した微生物やDNAのコンタミリスクを避けるため，密閉したマイクロチューブ内での，AGMの作製を検討した．
単にアルギン酸とアガロースの懸濁物とオイルを，撹拌によりエマルジョン化すると，アルギン酸とアガロースの液滴はオイルより重いため，徐々に沈降して不定形のゲルを形成した．そこでマイクロチューブ内で，ゲル化剤によりオイルをゲル化して（オルガノゲル）沈降を防いだ後，アガロースをゲル化して，AGMを作製した．
このようにして簡便なAGMの作製方法を確立した後，実証実験としてモデル微生物であるE. coliを内包したアルギン酸ゲルコアをEmulsification-Internal Gelation法により作製した後，オルガノゲル中でゲル化して，AGMを作製した．WGAにおけるゲル化の寄与を調べたところ，内部をゾル化したWGAの方が，顕著な増幅を示した．次に大腸菌を内包したAGM (E. coli-AGM) を一次WGAした後，一菌体を含むAGMをマイクロマニピュレーターで単離した．単離したE. coli-AGMは，次世代シーケンスに必要なDNA量を得るため，アガロースシェルを溶解後二次WGAを行い，次世代シーケンサーによる増幅バイアス抑制の評価を行っている．

Strategy for Future Research Activity

今後実際にシロアリ腸内原生生物共生細菌 (Okuma, 2015)や，マウス腸内粘膜内微生物難培養微生物，またアトピー皮膚炎微生物等の解析に用い，YUMネットワーク解析への本法の有用性を評価する．
現在のAGMは，形態学上特徴のある微生物はでも単離可能であるが，多くの微生物は形態では識別困難で，単離時に既知か，あるいは未知の微生物か判別困難である．そこで特定の遺伝子配列を指標にした，AGMの単離方法を開発する．これまで微生物の蛍光in-situハイブリダイゼーション (FISH) には16S rRNAなどコピー数が多く，蛍光DNA/RNAプローブの結合量が多いため，検出の容易な遺伝子が用いられた．一方その微生物にとって固有の機能を示す遺伝子の多くはシングルコピーで，FISHによる検出が困難だった．しかしAGMは単一微生物由来の染色体DNAをAGM内で増幅するため，シングルコピー遺伝子の検出も可能になると考えられる．そのため本法を用い，その微生物集団（microbiome）にとって，特徴のある遺伝子（例えば栄養代謝，シグナル伝達，あるいは毒素等）をプローブに用いたAGMライブラリーのスクリーニング方法を確立し，YUM microbiomeの微生物間ネットワーク解析を行う．

Causes of Carryover

当初購入予定のバイオセーフティキャビネットについて，別予算で購入できたため，研究予算の有効活用を図るため，次年度への繰越とした．

Expenditure Plan for Carryover Budget

繰越額については，次世代シーケンサー用試薬キットの購入等に使用する．