2017 Fiscal Year Research-status Report
小分子RNAをガイド鎖とするDNAサイレンシング機構の解明
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16K07246
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| Research Institution | Matsumoto Dental University |
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Principal Investigator |
三好 智博 松本歯科大学, 歯学部, 講師 (60534550)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
伊東 孝祐 新潟大学, 自然科学系, 助教 (20502397)
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| Project Period (FY) |
2016-04-01 – 2019-03-31
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| Keywords | Argonaute / small RNA / DNAサイレンシング |
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| Outline of Annual Research Achievements |
Argonauteタンパク質が作用機序の中枢を担っているRNA干渉（RNA interference）は、小分子RNAをガイド鎖として、その塩基配列特異的にターゲットRNAを分解する生体内メカニズムである。このRNA干渉は、真核細胞に特有の機構であるが、その一方で原核生物にもArgonauteは存在するがその機能は未解明のままであった。主にH29年度は、この原核型RsAgoの核酸選択能（RNA/DNA）を解明することにより、細胞内における機能を明らかにする研究に取り組んだ。RsAgoの核酸認識機構を探るために、RNAとDNAが混合した様々な種類の核酸を用いて、RsAgoへの結合実験を行ったところ、ガイド鎖の5’領域がRNA分子であり、同時にその領域の相補鎖をDNA分子にしたときにのみRsAgoとの核酸結合を観察することができた。この実験結果から、RsAgoの核酸認識は、ガイド鎖の5’領域及びその相補鎖との2本鎖領域の構造であることが明らかとなった。さらに、この領域のタンパク質と核酸の相互作用を立体構造解析データから調べた結果、PIWIドメインとMIDドメインにより認識されていた。さらに、原核型RsAgoでは、真核型とタンパク質の構造を比較したところL2リンカー領域に特徴的な構造が見られた。以上の結果から、これらのタンパク質の構造の違いにより、特徴的な核酸結合様式を取り得ることが明らかとなった。この結果は、原核型Argonauteの機能の解明にとどまらず、真核型ArgonauteのRNA干渉を応用した効率的ノックダウン実験の核酸分子の設計にも大きく貢献できる結果が得られた。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
3: Progress in research has been slightly delayed.
Reason
本研究は、原核生物に備わるRNA-guided DNA interference機構のメカニズムを明らかにすることである。 RsAgoに結合するガイドRNA鎖(約18塩基長)は、RNA-guided DNA interferenceシステムのトリガーとなる重要な核酸分子である。その生合成経路に関する知見はない。しかし、我々の構造解析の結果から、RsAgoには、ガイド鎖の5’末端のウラシル塩基を特異的に認識する機構が備わっていることを示唆する結果が得られた。さらに、ゲルシフト法により、40塩基長の長鎖RNAも成熟型RNAと考えられる18塩基長RNAと同様の結合力でRsAgoに結合することを明らかにした。これらの結果から、RsAgoに結合する小分子RNAの前駆体が、5’末端ウラシルである長い1本鎖RNAである可能性が高いと考えられている。本実験計画として、下記の(a)~(e)の実験により、この小分子RNAプロセシングモデルの正当性の検証を進めている。 (a)ガイド鎖5’末端塩基の特異性、(b)長鎖RNAのプロセシング過程、(c)小分子RNA成熟化因子の同定、(d)構造的特徴と機能との関連性、(e) DNAサイレンシングの分子メカニズムの解明。(a)に関しては、研究実績の概要でも記述したように、構造学的に示唆されていたRsAgoの機能を生化学的解析により、明確にすることができた。さらに、(d)の研究に関しても、RsAgoのガイド鎖とターゲット鎖の核酸認識メカニズムを明らかにし研究成果が得られたことから、ある程度進捗していると考えているが、全体として、申請段階における当初の研究進捗予定より遅れているので、現在までの進捗状況を「やや遅れている」と評価した 。
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| Strategy for Future Research Activity |
本研究の大まかな研究手順は、(a)ガイド鎖5’末端塩基の特異性、(b)長鎖RNAのプロセシング過程、(c)小分子RNA成熟化因子の同定、(d)構造的特徴と機能との関連性、(e) DNAサイレンシングの分子メカニズムの解明、に関する研究を予定している。 平成28年度と平成29年度の研究では、主に上記の実験計画(a)ガイド鎖5’末端塩基の特異性に関するデータと(d)構造的特徴と機能との関連性に関して、大きく研究が進んだ。しかしながら(b)長鎖RNAのプロセシング過程、(c)小分子RNA成熟化因子の同定に関する研究に関しては、予定通り進んでいない。現在、平成29年度に行う予定であった上記の長鎖RNAのプロセシング過程、小分子RNA成熟化因子の同定に関する研究を進めているが、これらの研究が完了次第、平成30年度の主な研究計画である「RsAgoの構造的特徴と機能との関連性」及び「DNAサイレンシングの分子メカニズムの解明」に関して研究を進めていきたいと考えている。
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| Causes of Carryover |
H28年度とH29年度において、(a)ガイド鎖5’末端塩基の特異性に関するデータと(d)構造的特徴と機能との関連性に関して、大きく研究が進んだ。しかしながら、当初の予定より（a）と（d）の研究に関して研究期間が長期化したため、遂行されていない実験があり次年度使用額が生じた。この次年度使用額に関しては、H30年度に行う(b)長鎖RNAのプロセシング過程、(c)小分子RNA成熟化因子の同定に関する研究で使用する予定である。
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