定量的プロテオミクスによる複製フォーク安定化メカニズムの網羅的解析

2016 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 16K07252
• Research Institution: Kyoto University
• Principal Investigator: 山田 正之 京都大学, 医学研究科, 特定准教授 (40398798)
• Project Period (FY): 2016-04-01 – 2020-03-31
• Keywords: 複製フォーク / ユビキチン化 / 脱ユビキチン化 / Cdc7 / Chk1 / プロテオミクス / ゲノム安定性

Outline of Annual Research Achievements

1.脱ユビキチン化酵素USP7によるASKタンパク質安定化の分子メカニズムの解明。
U2OS細胞にpcDNA6/TR vectorとpcDNA4/TO-USP7 (WT) vectorを安定的に発現させた細胞株を樹立した。この細胞株を用いて、野生型USP7の過剰発現によってASKタンパク質が安定化することを確認した。また、不活性変異型USP7(C223S)を過剰発現させても上記の効果は認められないことも確認した。さらに、APC/C (Anaphase promoting complex/cyclosome)の活性制御サブユニットの１つであるCdh1タンパク質の過剰発現によるASKタンパク質の減少 (すでに発表済み)が野生型USP7の過剰発現によって抑えられることも見出した。これらの結果から脱ユビキチン化酵素USP7がASKタンパク質の安定化に重要な役割を果たしていることが示唆された。
2.AID (Auxin-induced degron)-Cdc7細胞株、AID-Chk1細胞株の樹立。
AID-tagを付加したCdc7またはChk1を発現するベクター(pAID-Cdc7, pAID-Chk1)を作成した。これらの発現ベクターを、293T細胞に一過性に導入(transient transfection)して、AID-Cdc7タンパク質、AID-Chk1タンパク質の発現を確認した。しかし、これらのベクターを各々、Cdc7ノックダウン細胞、Chk1ノックダウン細胞に安定的に導入した細胞株を樹立しようと試みたが、現在のところ目的の細胞株は得られていない。

Current Status of Research Progress

3: Progress in research has been slightly delayed.

Reason

AID-tagを付加したCdc7またはChk1を発現するベクター(pAID-Cdc7, pAID-Chk1)は作成し、293T細胞内でのAID-Cdc7, AID-Chk1の一過性発現は確認できたが、これらを各々、Cdc7ノックダウン細胞、Chk1ノックダウン細胞に安定的に導入した細胞株を樹立できていない(得られたクローンでのAID-Chk1タンパク質、AID-Cdc7タンパク質の発現が確認できない)。

Strategy for Future Research Activity

AID-Cdc7細胞株、AID-Chk1細胞株は本研究の中心課題であるプロテオミクス解析に用いるものであり、今後も樹立を試みる。もしこれらの細胞株の樹立がうまくいかない場合には、低分子キナーゼ阻害剤 (PHA-767491(Cdc7 inhibitor), UCN-01 (Chk1 inhibitor))の使用も検討し、プロテオミクス解析の条件検討を開始したい。

Causes of Carryover

技術補助員(テクニシャン)の雇用を計画していたが、適当な人材を見つけることができなかったため見送った。また、学会への参加を計画していたが、スケジュールが合わなかったため(大学での重要な講義と重なったため)断念した。

Expenditure Plan for Carryover Budget

消耗品の購入と国内学会(日本分子生物学会年会)への参加に使用する予定である。

Research Products

• [Int'l Joint Research] Danish Cancer Society Research Center(Denmark)
  • Country Name: Denmark
  • Counterpart Institution: Danish Cancer Society Research Center
• [Int'l Joint Research] Palacky University(チェコ)
  • Country Name: CZECH
  • Counterpart Institution: Palacky University
• [Int'l Joint Research] Karolinska Institute(Sweden)
  • Country Name: Sweden
  • Counterpart Institution: Karolinska Institute
• [Journal Article] Role of DNA repair factor XPC in response to replication stress, revealed by DNA fragile site affinity chromatography and quantitative proteomics (2016)
  • Author(s): Beresova L, Vesela E, Chamrad I, Voller J, Yamada M, Furst T, Lenobel R, Chroma K, Gursky J, Krizova K, Mistrik M, Bartek J.
  • Journal Title: Journal of Proteome Research Volume: 15 Pages: 4505-4517
  • DOI: 10.1021/acs.jproteome.6b00622
  • Peer Reviewed / Int'l Joint Research