2017 Fiscal Year Research-status Report
Comprehensive analysis of mechanisms for stalled replication fork stabilization by quantitative proteomics
| Project/Area Number |
16K07252
|
|---|
| Research Institution | Kyoto University |
|---|
Principal Investigator |
山田 正之 京都大学, 医学研究科, 特定准教授 (40398798)
|
|---|
| Project Period (FY) |
2016-04-01 – 2020-03-31
|
| Keywords | Cdc7-ASK/Dbf4 kinase / deubiquitinase / protein stability / proteomics / replisome stability |
|---|
| Outline of Annual Research Achievements |
1.脱ユビキチン化酵素USP7によるASKタンパク質安定化の分子メカニズムの解明。
U2OS細胞にUSP7に対するsiRNAを導入するとASKたんぱく質の減少が観察された。逆に、U2OS細胞への野生型USP7の過剰発現によってASKタンパク質が安定化することを確認した。また、不活性変異型USP7(C223S)を過剰発現させても上記の効果が認められないことも確認した。さらに、APC/C (Anaphase promoting complex/cyclosome)の活性制御サブユニットの1つであるCdh1タンパク質の過剰発現によるASKタンパク質の減少 (すでに発表済み)が野生型USP7の過剰発現によって抑えられることも見出した。また、免疫沈降法によって、ASKとUSP7の結合を確認した。これらの結果からUSP7がASKタンパク質の安定化に重要な役割を果たしていることが示唆された。
2.AID (Auxin-induced degron)-Cdc7細胞株、AID-Chk1細胞株の樹立。
AID-tagを付加したCdc7またはChk1を発現するべクター(pAID-Cdc7, pAID-Chk1)を作成した。これらの発現べクターを、293T細胞に一過性に導入して、AID-Cdc7タンパク質、AID-Chk1タンパク質の発現を確認した。しかし、これらのべクター を各々、Cdc7ノックダウン細胞、Chk1ノックダウン細胞に安定的に導入した細胞株を樹立しようと試みたが、現在のところ目的の細胞株は得られていない。
3.Cdc7キナーゼによる複製フォーク安定化のメカニズム
U2OS細胞において、hydroxyureaでDNA複製フォークの進行を阻害した状態でCdc7キナーゼの活性を阻害すると、フォークに結合しているタンパク質の一部がクロマチンから脱落することを見いだした。
|
| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
3: Progress in research has been slightly delayed.
Reason
AID-tagを付加したCdc7またはChk1を発現するべクター(pAID-Cdc7, pAID-Chk1)は作成し、293T細胞内でのAID-Cdc7, AID-Chk1の一過性発現は確認できたが、これらを各々、Cdc7ノックダウン細胞、Chk1ノックダウン細胞に安定的に導入した細胞株を樹立できていない (得られたクローンでのAID-Chk1タンパク質、AID-Cdc7タンパク質の発現量が低く、Cdc7ノックダウン細胞、Chk1ノックダウン細胞をレスキューできない)。
|
| Strategy for Future Research Activity |
AID-Cdc7細胞株、AID-Chk1細胞株は本研究の中心課題であるプロテオミクス解析に用いるものであり、今後も樹立を試みる。U2OSだけでなく、他の細胞株(例えばHeLa)も用いる予定である。もしこれらの細胞株の樹立がうまくいかない場合には、AID-ASK細胞株、AID-Claspin細胞株(ASK、Claspinはそれぞれ、Cdc7、Chk1の活性化因子である)の樹立を検討する。また、低分子キナーゼ阻害剤 (PHA-767491(Cdc7 inhibitor), UCN-01 (Chk1 inhibitor))の使用も検討し、プロテオミクス解析の条件検討を行う。
|
| Causes of Carryover |
(理由) 技術補助員(テクニシャン)の雇用を計画していたが、適当な人材を見つけることができなかったため見送った。また、学会への参加を計画していたが、スケジュールが合わなかったため(大学での重要な講義と重なったため)断念した。
(使用計画) 消耗品や試薬の購入に使用する予定である。
|
