2016 Fiscal Year Research-status Report
DNAからのPCNAクリアランス機構の多様性の解析
| Project/Area Number |
16K07257
|
|---|
| Research Institution | University of Hyogo |
|---|
Principal Investigator |
塩見 泰史 兵庫県立大学, 生命理学研究科, 准教授 (80380567)
|
|---|
| Project Period (FY) |
2016-04-01 – 2019-03-31
|
| Keywords | PCNA / RFC複合体 / PCNAローディング / PCNAアンローディング / PCNAクリアランス / ゲノム維持 |
|---|
| Outline of Annual Research Achievements |
当該年度には、①精製RFC複合体によるPCNAアンロードの解析、②アンロードされるPCNAの特性の解析を計画していた。
①については過去の解析結果から、PCNAローダーであるRFC1-RFCとは異なり、アンローダーであるElg1-RFCはPCNAと結合しない、という前提で計画していた。しかし、後述の質量分析などでの解析から、それぞれは同等にPCNA結合することが分かってきた。そこで、それぞれの複合体について、ローダーとアンローダーを定義するものは何か、という計画を新たに立てて解析を進めようとしている。
②に関連して、3つのRFC複合体のPCNAを含めた相互作用因子の特異性を明らかにするため、RFC複合体のそれぞれに特異的なサブユニットにFLAGタグを付加して発現させた細胞抽出液から免疫沈降を行い、結合してきた因子を質量分析により解析した。
その結果、細胞内でPCNAローダーとアンローダーとしての役割が明確なRFC1-RFCとElg1-RFCには共通した結合因子が多く存在しており、一方、その細胞内での役割に不明な点が多いCtf18-RFCには、RFC1-RFCやElg1-RFCにはみられないユニークな結合因子が存在した。この結果は、RFC複合体によるPCNA着脱と連係した染色体制御の新しい知見につながると考え解析を進めている。
加えて、オーキシンの添加で速やかにRFC複合体を機能抑制できるAID法によるコンディショナル変異細胞株の作製を行い、Elg1-RFCについて細胞株を樹立した。これまでは細胞内RFC複合体の機能をRNAi法により解析していたが、コンディショナル変異細胞株により解析を簡便に、また、細胞周期同調とリンクさせて行えるようになった。現在、RFC1-RFC、Ctf18-RFCでも同様に細胞株の作製を行っており、これを細胞内での機能解析に利用していく計画である。
|
| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
当初の研究計画に沿っていない部分もあるが、質量分析によるRFC複合体の相互作用因子の解析によって、相互作用因子に対するRFC複合体間での特異性や普遍性などクラス分けの知見が得られた点は大きな成果と考えている。この結果は、今後の細胞内におけるPCNAクリアランスの多様性の解析に発展させていきたい。また、当初の研究計画にはなかったが、今後の解析の展開を考えた場合に有用なAID法によるコンディショナル変異細胞株を作製することができた。Elg1-RFCについてはコンディショナル変異細胞株が確立し、Elg1分解時にはRNAiの場合と同様の細胞表現系を示すことを確認できている。現在、RFC1-RFC、Ctf18-RFCについても同様の細胞株の作製を行っているので、これらを今後の細胞内でのRFC複合体の機能解析に利用していきたい。
これらの成果を合わせて、研究課題はおおむね順調に進展していると考えている。
|
| Strategy for Future Research Activity |
当該年度に得られた、RFC複合体に特異的な相互作用因子の解析結果を踏まえて、また、AID法によるコンディショナル変異細胞株を有効に利用して29年度以降の研究計画にある、細胞周期S期以外でのPCNAクリアランスの解析を進めていく。
当初の研究計画の、精製RFC複合体によるPCNAアンロード特性の解析については、計画段階でローダーであるRFC1-RFCのように、アンローダーであるElg1-RFCはPCNAと結合しない、という解析結果から計画していたが、上記の質量分析など解析を進めていくと、それぞれは同等にPCNAと結合するということが分かってきた。そこで、それぞれのタンパク質について、どのアミノ酸配列（モチーフ）がローダーとアンローダーを定義するか、という新たな解析目標を立てているので、この点についても解析を進めていく。
|
| Causes of Carryover |
物品費の一部を、大学から支給された費用でまかなったため、次年度使用額が生じた。
|
| Expenditure Plan for Carryover Budget |
追加の研究計画の実行を予定しているので、その遂行に必要な物品費に使用する。
|
